任意數量離散不規則感興趣區域的快速熒光壽命顯微成像*

牛敬敬 劉雄波 陳鵬發 于斌 嚴偉 屈軍樂 林丹櫻

(深圳大學生物醫學光子學研究中心/物理與光電工程學院,光電子器件與系統重點實驗室,深圳 518060)

熒光壽命顯微成像(fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM)技術在細胞微環境傳感中具有特異性強、靈敏度高、可定量的優點,被廣泛應用于生物醫學研究.其中,基于時間相關單光子計數(time-correlated single photon counting,TCSPC)進行熒光壽命探測的方法是目前最常用的技術之一,但受成像原理和條件限制,該技術存在數據采集時間較長、成像速度不夠快的不足.本文開發一種能對生物樣品中任意數量離散的、形狀不規則的感興趣區域(region of interest,ROI)進行快速FLIM 成像的技術.該技術利用聲光偏轉器(acousto-optic deflector,AOD)實現快速靈活的尋址掃描,并通過對ROI 形狀特征的簡單在線分析,實現AOD 與TCSPC 同步策略的優化及壽命圖像的準確重構,對于生物樣品中常見的存在多個離散不規則ROI情形,可大幅節省數據采集時間,從而實現對這些ROI 的快速FLIM 成像.采用該技術,對氯化銨刺激下活細胞中溶酶體探針LysoSensor Green DND-189 的熒光壽命變化進行了動態FLIM 成像,以監測溶酶體管腔內pH 值的實時變化情況.結果表明,該快速FLIM 技術可用于動態監測生物樣品中微環境的變化,將在活細胞微環境傳感中發揮重要作用.

1 引言

熒光壽命顯微成像(fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM)技術在測量細胞微環境的離子濃度、黏度、折射率、溫度和pH 值等生化參數時具有特異性強、靈敏度高、可定量的優點[1?3],因而在生物醫學領域中有著較為廣泛的應用,成為生物醫學研究的重要工具.在各種FLIM 技術中,采用時間相關單光子計數(time-correlated single photon counting,TCSPC)的方法實現熒光壽命探測是目前最常用的做法,其原理是采用高重復頻率的脈沖激光激發樣品,同時由高靈敏度的探測器如光電倍增管(photomultiplier tube,PMT)探測單光子熒光信號,通過獲取每個激發周期內熒光光子到達探測器的時間并進行計數,得到近似熒光強度衰減曲線的光子數-時間分布直方圖,從而擬合或計算得到熒光壽命值[4?8].一般而言,為了得到準確的熒光壽命值,該方法要求激發光不能太強以避免一個周期產生多個熒光光子的“光子堆積”效應,但同時又要求每個像素點累積足夠多的光子數用于壽命擬合[9?11],因此實際應用中通常將TCSPC-FLIM 與激光掃描共聚焦顯微術[12](laser scanning confocal microscopy,LSCM)或雙光子激發熒光顯微術[13](Two-photon excited fluorescence microscopy,TPEFM)結合,通過重復多次的逐點掃描來累積光子數,實現FLIM 成像.

傳統的掃描成像系統通常采用振鏡對成像視場進行柵掃描,掃描方式不夠靈活,且掃描時存在機械慣性,成像速度受到限制.聲光偏轉器(acousto-optic deflector,AOD)利用聲光晶體的聲光效應,可通過加載不同的聲波頻率改變其出射光的衍射角,從而實現光束的線性偏轉,代替振鏡作為掃描器件.相比振鏡掃描,AOD 掃描不存在機械慣性問題,掃描速度快,重復精度高,并且由于兩個維度的偏轉可獨立控制,掃描方式很靈活,可實現跳躍性的快速尋址掃描[14,15].2013 年,深圳大學屈軍樂課題組[16]首次將AOD 尋址掃描應用于TCSPC-FLIM,實現了對任意形狀感興趣區域(region of interest,ROI)的FLIM 成像.在該工作中,AOD掃描與TCSPC 數據采集之間只有一個同步信號,控制方式簡單,成像靈活.但這種方法由于需要逐點存儲壽命數據再進行下一個像素點的采集,因此即使是對較小視場進行成像通常也需要很長的采集時間(如10×10 像素需要3 min),成像速度較慢,并不適用于快速生物醫學過程的研究.2014 年,該課題組改用像素、行、幀三個信號對AOD 掃描和TCSPC 采集進行同步控制,從而大幅節省了采集和存儲時間,提升了成像速度,實現了壞死因子(TNF-α)誘導癌細胞凋亡過程的FLIM 成像,以監測其黏度和pH 值的變化過程,FLIM 成像速度達到了10 s/幀[17].然而,實際應用中這種同步控制方式僅適用于單個矩形區域的掃描成像,否則后期數據重構將過于復雜耗時,從而使AOD 快速尋址掃描的優勢不能很好發揮出來,失去了對任意形狀ROI 尋址掃描的靈活性,對存在多個ROI 的情形更加無能為力.針對生物醫學研究中常見的存在多個離散不規則ROI 的情形,本文在上述工作的基礎上,通過對ROI 的形狀特征進行簡單的在線分析,對AOD 掃描與TCSPC采集之間的同步控制方式進行優化,并發展相應的壽命圖像數據處理方法,可方便地實現對視場中任意數量的離散、不規則ROI 的快速FLIM 成像,為FLIM 技術在活細胞微環境傳感等領域的應用提供了一種新的手段.

2 系統與方法

2.1 快速FLIM 系統的搭建

圖1 為搭建的快速FLIM 系統示意圖.以商用倒置熒光顯微鏡(Ti2-U,Nikon)為框架,采用鈦寶石可調諧飛秒脈沖激光器(Chameleon Ultra II,Coherent)作為雙光子激發光源,常用波長為800 nm,峰值功率為3.8 W,重復頻率為80 MHz.激光經半波片HWP 和偏振分束棱鏡PBS 調節功率、擴束鏡BE1 擴束準直和光束提升鏡BL 提升后進入二維AOD 掃描器2D-AOD.但由于AOD 中的聲光晶體為大色散介質,需在AOD 前引入一個色散棱鏡DP 對其引起的空間和時間色散進行預校正[18].2D-AOD 由一對正交放置的AOD (DTSXY-400-640,AA Opto-electronic)組成,激光經AOD 產生的衍射光偏轉角由加載在聲光晶體上的聲波頻率決定,因此采用衍射光作為掃描光時,通過加載不同的聲波頻率,就可以實現X-Y二維平面內任意點的跳躍性掃描.聲波頻率信號由數據采集卡(USB-6353,National Instruments)輸出的數字信號轉換而成.掃描光經擴束鏡BE2 擴束準直后進入顯微鏡,經物鏡O (100×/1.45 NA,Nikon)聚焦激發樣品.產生的熒光經二向色鏡DM、濾光片FT 和反射/透射比7:3 的分束鏡BS 同時被 PMT(PMC-100-0,Becker &Hickl GmbH)和EMCCD(DU897,Andor)收集.EMCCD 采集的熒光信號用于選取ROI;PMT 采集的熒光信號經放大后傳輸給TCSPC 采集卡(SPC-150,Becker &Hickl GmbH)處理得到壽命數據,并在計算機上由采集和分析軟件(SPCM,Becker &Hickl GmbH)存儲并實時顯示為熒光強度圖像,隨后可在該軟件(或其他壽命分析軟件)中分析得到各像素點的熒光壽命并顯示為熒光壽命圖像.

圖1 快速FLIM 系統示意圖Fig.1.Schematic diagram of fast FLIM system.

2.2 同步信號的產生策略

AOD 掃描與TCSPC 壽命數據的采集和存儲之間的同步控制,是上述快速FLIM 系統得以正常工作并獲得正確的熒光壽命圖像的關鍵.采用同一數據采集卡輸出的3 個脈沖信號作為像素(pixel)、行(line)、幀(frame)同步信號,分別控制壽命數據存儲時的像素與像素、行與行、幀與幀之間的切換[19],其中像素信號需要與控制AOD 掃描的數字信號保持嚴格同步,行信號由掃描區域中每行的像素個數決定,幀信號則由掃描區域的總像素數決定.通常情況下,三路同步信號均為周期信號,周期長度可根據掃描區域的行列數提前設定好.以掃描一個5×2 像素的矩形ROI 為例,控制AOD 掃描的數字信號和三路同步信號如圖2(a)所示,AOD掃描區域如圖2(b)所示,而TCSPC 數據采集和存儲如圖2(c)所示,其中數字代表數據存儲順序,不同顏色代表不同壽命值.

圖2 AOD 掃描信號及其與TCSPC 的同步原理示意圖 (a)數字信號及三路同步信號;(b) AOD 掃描過程;(c) AOD-TCSPC同步過程Fig.2.Schematic diagram of AOD scanning signal and its synchronization principle with TCSPC:(a) Digital signal and three synchronization signals;(b) AOD scanning process;(c) AOD-TCSPC synchronization process.

但顯然這種同步信號的產生策略只適用于單個矩形ROI,對于形狀不規則的或者多個離散的ROI 則不適用.為了實現對任意數量離散不規則ROI 的快速FLIM 成像,需要對同步信號的產生策略進行優化,使其能夠與所選ROI 的形狀特點相對應,以得到正確的熒光壽命圖像.以圖3(a)所示的3 個離散不規則ROI 為例,為了產生與其盡量匹配的同步信號,同時便于后期數據處理,需要對ROI 的形狀特征進行在線分析.首先,找出包含所有ROI 的外接矩形區域(即圖中所示的6×6 像素區域),保存該外接矩形區域像素點的坐標信息,用于后期數據處理;然后,計算每一行需要掃描的像素數(如第一行為3 個像素),用于調整行信號的輸出,即產生的同步信號應如圖3(b) 和圖3(c)所示,其中行信號不再是周期信號,相鄰行信號脈沖的間距由當前行需要掃描的像素數決定.根據這種策略產生的三路同步信號與所選ROI 的形狀是相對應的,因此對于任意數量任意形狀的ROI 都是適用的,也包括前面提到的單個矩形ROI.值得指出的是,對于沒有像素點需要掃描的“空行”,實際上并不會有行信號產生,同時由于TCSPC 數據存儲是順序無結構的,因此存儲下來的熒光壽命數據并不完全與ROI 中各像素點的實際掃描位置相對應,如圖3(d)所示,即存儲下來的壽命數據仍存在未關聯到準確空間位置的問題,需要進一步映射處理以得到準確的壽命圖像.

圖3 針對任意數量離散不規則ROI 的同步信號產生新策略示意圖 (a)三個離散的不同形狀ROI(灰色);(b)每個掃描點所需的同步信號;(c)按新策略產生的三路同步信號;(d)已分行存儲但仍未準確映射的熒光壽命數據Fig.3.Schematic diagram of a new strategy for generating synchronization signals for any number of discrete irregular ROIs:(a) Three discrete ROIs of different shapes (gray);(b) the synchronization signals required for each scan point;(c) three synchronization signals generated according to the new strategy;(d) fluorescence lifetime image data that has been stored in rows before mapping.

2.3 壽命圖像的重建

結合前面ROI 形狀分析得到的外接矩形區域信息,可以方便地對已分行存儲的壽命數據進行映射處理,即將每個像素點得到的壽命數據移位到其實際的掃描位置處,以重構出準確的熒光壽命圖像.具體過程如圖4 所示.

首先,如圖4(a)—(c)所示,將掃描ROI 的坐標信息與其外接矩形區域的坐標信息進行比較(取交集),可得到一個二值化矩陣(圖中數字表示非零元素,對應ROI 內的掃描像素).然后,如圖4(d)—圖4(f)所示,將該二值化矩陣中非零元素的列坐標(圖4(d)中數字所示)與TCSPC 順序存儲時的列坐標(圖4(e)中數字所示,參考圖3(d))進行比較(相減),可計算得到每個像素的橫向相對位移(圖4(f)中數字所示),稱圖4(f)的矩陣為X方向的移位矩陣.同理,通過比較行坐標(圖4(g)和圖4(h))可得到Y方向的移位矩陣,如圖4(i)所示.利用這兩個移位矩陣,就可以對壽命數據矩陣(圖4(j))進行移位操作,從而得到準確的壽命圖像,其中X方向移位操作結果如圖4(k)所示,繼續進行Y方向的移位操作后,可得到如圖4(l)所示的壽命圖像.

圖4 壽命數據處理方法示意圖 (a)掃描ROI;(b)外接矩形;(c)二值化矩陣;(d)二值化矩陣非零元素列坐標;(e)壽命數據順序存儲列坐標;(f) X 方向移位矩陣;(g)二值化矩陣非零元素行坐標;(h)壽命數據順序存儲行坐標;(i) Y 方向移位矩陣;(j)未移位的壽命圖像;(k) X 方向移位后的壽命圖像;(l) Y 方向移位后的準確壽命圖像Fig.4.Schematic diagram of the processing method for the lifetime image data:(a) Scanned ROIs;(b) circumscribed rectangle;(c) binarized matrix;(d) column coordinates of non-zero elements in the binarized matrix;(e) column coordinates of the lifetime data before mapping;(f) shift matrix in X-direction;(g) row coordinates of non-zero elements in the binarized matrix;(h) row coordinates of the lifetime data before mapping;(i) shift matrix in Y-direction;(j) lifetime image before mapping;(k) lifetime image after shift in X-direction;(l) correct lifetime image after shift in Y-direction.

這樣,通過在線分析所選ROI 的形狀特征并獲取其外接矩形區域的像素信息,不僅優化了同步信號的產生策略,使得TCSPC 采集和存儲的壽命數據分行存儲,還可以通過簡單的運算對壽命數據進行映射處理得到準確的壽命圖像,從而實現對任意數量任意形狀ROI 的快速FLIM 成像.

3 結果與討論

3.1 任意數量離散不規則ROI 成像驗證

為了驗證上述方法對任意數量離散不規則ROI 的成像能力,以鈴蘭根莖切片(從Leica 公司采購的標準樣片)為例進行成像,結果如圖5 所示.其中圖5(a)為EMCCD 采集的樣品明場圖像,通過LabVIEW 編寫的控制程序可在其上根據需要選取ROI(也可以在EMCCD 采集的寬場熒光圖像上選取),選取時可采用預設的形狀,也可以直接用鼠標圈選任意不規則形狀,如圖中綠色圖形所示.完成選區后,數據采集卡產生對應ROI 坐標信息的數字信號,控制AOD 對激光進行偏轉,實現對選定ROI 的掃描和激發;同時,程序自動完成如前文所述的ROI 形狀特征在線分析,并控制數據采集卡按照新策略產生對應的三路同步信號,控制TCSPC 開始采集和存儲相應的壽命數據.圖5(b)為掃描過程中EMCCD 拍攝的熒光強度圖像,可以看到只有所選ROI 以內的樣品被激發出熒光,其余部分沒有信號.圖5(c)為利用TCSPC 采集的數據直接分析得到的熒光壽命圖像,可以看出壽命數據已分行存儲,但由于未將壽命信息關聯到準確的位置,圖像不能反映樣品的真實結構.圖5(d)為移位處理后的熒光壽命圖像,可以看到圖像中四個ROI 的結構均與圖5(b)所示的熒光強度圖像符合得很好.

圖5 鈴蘭根莖切片樣品多個離散的不同形狀ROI 的FLIM成像 (a)明場圖像及ROI 的選取;(b) EMCCD 采集的熒光強度圖像;(c) TCSPC 采集得到的壽命圖像;(d)準確重構的熒光壽命圖像Fig.5.FLIM imaging of multiple discrete ROIs of different shapes in convallaria slice sample:(a) Bright field image collected by EMCCD and selection of ROIs;(b) fluorescence intensity image collected by EMCCD;(c) lifetime image collected by TCSPC;(d) corrected fluorescence lifetime image.

3.2 成像速度對比分析

本文所提的方法能夠實現對ROI 的快速FLIM成像,本質上是因為采用了尋址掃描方式,對于多個離散的、形狀不規則的ROI 而言,可以大幅減少非感興趣像素點的數量,從而間接提高成像速度.以鈴蘭根莖切片樣品為例,假設有生物學意義的ROI 為圖6(a)所示的環形區域,采用本文方法進行FLIM 成像得到的結果如圖6 所示,其中圖6(b)為EMCCD采集的熒光強度圖像,圖6(c)為TCSPC 采集的光子計數累積得到的熒光強度圖像,圖6(d)為利用TCSPC 采集的光子計數進行分析和重構后得到的熒光壽命圖像.作為對比,圖7 所示為掃描包含該環形ROI 的矩形區域時得到的結果.可見,當感興趣的結構只是圖中環形ROI 部分時,采用本文的尋址掃描成像方式可以只采集環形ROI 中的數據,而傳統柵掃描方式則至少需要對包含該ROI 的整個矩形區域進行掃描,因而將許多原本不需要的像素包括在內,既增加了數據采集時間,也增加了數據處理負擔.定量地,可統計得到圖6中環形ROI 包含的像素數為6164,而圖7 中矩形ROI 包含的像素數為15625,在保證單像素采集的最大光子數基本一致(分別為841 和824)的前提下,圖6 和圖7 的采集時間分別為3.0 s 和7.8 s,即由于環形ROI 像素數僅為矩形的約39%,相應的采集時間縮短為矩形的38%,采集時間隨著掃描像素數的減少而成比例地減少.

圖6 鈴蘭根莖切片樣品環形ROI 的FLIM 成像 (a)環形ROI 的選取;(b) EMCCD 采集的熒光強度圖像;(c) TCSPC采集的熒光強度圖像;(d)熒光壽命圖像Fig.6.FLIM imaging of a circular ROI in convallaria slice sample:(a) Selection of the circular ROI;(b) fluorescence intensity image collected by EMCCD;(c) fluorescence intensity image collected by TCSPC;(d) fluorescence lifetime image.

圖7 鈴蘭根莖切片樣品矩形ROI 的FLIM 成像 (a)矩形ROI 的選取;(b) EMCCD 采集的熒光強度圖像;(c) TCSPC采集的熒光強度圖像;(d)熒光壽命圖像Fig.7.FLIM imaging of a rectangular ROI in convallaria slice sample:(a) Selection of the rectangular ROI;(b) fluorescence intensity image collected by EMCCD;(c) fluorescence intensity image collected by TCSPC;(d) fluorescence lifetime image.

在生物醫學成像實驗中,ROI 呈離散不規則分布的情況是非常多見的,例如對于細胞核或者細胞中其他細胞器的研究等.因此,對于這些情形,采用本文的方法可以大幅縮短數據采集時間,提高FLIM 成像速度.ROI 越小、越分散,采用這種方法的優勢就越明顯.特別地,當感興趣區域是一些離散點時,采用本文的方法不僅方便,而且可以達到非常快的成像速度.為了驗證這一點,采用平鋪在蓋玻片上的羅丹明6 G 溶液為樣品,選取視場內構成“FAST FLIM”圖樣的87 個離散點進行成像,結果如圖8 所示.由于掃描的像素數量非常少,熒光壽命圖像采集時間僅為52.2 ms,成像速度非常快.而傳統成像方式很難做到這一點,這是因為雖然TCSPC 采集時也有單點探測模式,但其探測的點是不能根據需求任意指定的,只能是視場中央的一個點,一般用于調試采集參數.而采用本文的成像方式,即AOD 尋址掃描結合TCSPC 三路同步信號產生的新策略和圖像數據處理方法,就可以方便地做到任意離散點的快速FLIM 成像.

圖8 羅丹明6G 溶液樣品中離散點的快速FLIM 成像 (a)離散像素點的選取;(b) EMCCD 采集的熒光強度圖像;(c) TCSPC采集的熒光強度圖像;(d)熒光壽命圖像Fig.8.Fast FLIM imaging of discrete pixels in rhodamine 6G solution:(a) Selection of the discrete pixels;(b) fluorescence intensity image collected by EMCCD; (c) fluorescence intensity image collected by TCSPC;(d) fluorescence lifetime image.

3.3 活細胞成像應用

利用本文的快速FLIM 成像方法,對氯化銨刺激下活細胞中溶酶體探針的熒光壽命變化進行動態成像,以監測溶酶體管腔內pH 值的變化情況.實驗采用對pH 敏感的探針LysoSensor Green DND-189 標記人肉骨瘤細胞(U2OS,37 ℃、5% CO2孵育)中的溶酶體(標記濃度1 μM (1 M=1 mol/L),孵育時間30 min).首先如圖9(a)—(b)所示,選取一個感興趣細胞并拍攝其明場圖像和寬場熒光強度圖像,發現溶酶體的熒光信號比較集中,進而選擇“1”和“2”兩個ROI進行快速FLIM 成像,單幅采集時間為200 ms.成像過程中加入10 μL 濃度為1 μM 的氯化銨溶液對活細胞進行刺激,并記錄加入氯化銨溶液后5 min 內ROI 中的熒光壽命圖像,結果如圖9(c)和圖9(d)所示,其中圖9(c)表示加入氯化銨溶液刺激后兩個ROI 中溶酶體探針平均熒光壽命的變化,圖9(d)為部分時間點的熒光壽命圖像,時間點“0”對應尚未加入氯化銨溶液時的結果.可以看到,在氯化銨的刺激下,兩個ROI 中溶酶體探針的熒光壽命都是先急劇變短,然后再緩慢變長.根據文獻[20]報道的探針LysoSensor-DND189 的熒光壽命與pH 值的關系(即pH 值越高,探針的熒光壽命越短;反之亦然),該過程中溶酶體探針的熒光壽命變化代表的是其管腔內pH 值的變化情況,即在弱酸性溶液氯化銨的刺激下,活細胞中溶酶體管腔內的pH 先急劇增大,然后再緩慢回落.該動態結果很好地記錄了對于外界的突然刺激溶酶體管腔內pH 值的實時變化過程.而這種實時監測結果,利用傳統的TCSPC-FLIM 是無法獲得的.

圖 9 活細胞 中LysoSensor-DND189 標記溶 酶體的快速FLIM 成像 (a)明場圖像;(b) EMCCD 采集的熒光強度圖像及ROI 的選取;(c) ROI 平均熒光壽命隨氯化銨刺激時間的變化;(d)部分時間點的熒光壽命圖像Fig.9.Fast FLIM imaging of LysoSensor-DND189 labeled lysosomes in living cells:(a) Bright field image;(b) fluorescence intensity image collected by EMCCD and selection of ROIs;(c) the change of the average fluorescence lifetime in the ROIs with the stimulation time of ammonium chloride;(d) the fluorescence lifetime image of selected time points.

4 總結與展望

針對傳統TCSPC-FLIM 受成像原理和條件限制,存在數據采集時間長、成像速度不夠快的問題,本文開發了一種利用AOD 進行尋址掃描,并通過對ROI 形狀特征的在線分析和AOD-TCSPC同步策略的優化重構出準確壽命圖像的方法,從而實現了對任意數量的離散不規則ROI 的快速FLIM成像.本文詳細闡述了該快速FLIM 成像方法的原理和實現過程,并對該成像方法進行了實驗驗證和性能分析.結果表明,利用該方法對任意數量的離散不規則ROI 進行FLIM 成像均能夠得到正確反映樣品真實結構的熒光強度圖像和壽命圖像,并且由于避免了對非感興趣像素點的掃描,可大幅節省采集時間,實現快速FLIM 成像.采用該技術,對氯化銨刺激下活細胞中溶酶體探針LysoSensor-DND189 的熒光壽命變化進行了動態FLIM 成像,實現了溶酶體管腔內pH 值變化情況的動態監測.該方法將為動態監測生物樣品中某些感興趣對象(如細胞器等)的快速微環境變化提供很好的工具.