牙周炎伴口臭患者的唾液微生物群落分析

秦紅霞，胡文彬，高夢瑤

(鄭州大學第一附屬醫院 口腔科，河南 鄭州 450052)

口臭是用來表示呼吸或說話時從口腔呼出的異常氣味的術語。測量口臭的最基本方法是感官評分(organoleptic scoring，OLS)，盡管這種方法具有主觀性且缺乏可重復性，但這種方法仍然是金標準，因為人的鼻子可以分辨出最多種類的不同氣味[1]。口臭的病因相當復雜，口臭患者常被發現就診于口腔科。由于評估方法的不同，口臭的患病率也不同，口臭可分為口外口臭和口內口臭[1]。80%～90%的口臭源于口腔，舌苔和牙周狀況是最重要的風險因素[2-3]。造成口腔異味的主要化合物是揮發性硫化物(VSCs)，如硫化氫(H2S)、甲硫醇(CH3SH)和二甲基硫醚(CH3SCH3)[4]。

牙周炎是發生在牙周組織的一種慢性感染性疾病，是宿主防御機制與菌斑微生物相互作用的結果。牙齒表面生物膜中的微生物群落在牙周炎的發生發展中起到了重要的作用。Dhanani等[5]發現了口臭和牙周病之間可能的關系，即牙周袋中VSCs產量增加，這為牙周病患者口腔異味的加劇提供了一個合理的解釋。牙周炎能夠加重口腔異味的嚴重程度，也可能是由于可供細菌新陳代謝的底物數量增加[6]。在牙周炎患者中，上皮細胞的脫落和白細胞的滲出可以產生更多的含硫蛋白底物。Yegaki等[7]發現，探診出血和牙周袋深度與VSCs的產生呈正相關。

借助16SrRNA基因測序方法已經能夠對復雜的細菌群落進行全面的調查。有口臭的受試者的微生物群落比無口臭的受試者的微生物群落的多樣性更大，并且各種微生物均與口臭有關[8]。因此，本研究的目的是利用16SrRNA基因測序技術，對典型牙周炎伴口臭患者的唾液樣本以及牙周炎不伴口臭患者的唾液樣本與健康對照組進行分析，比較伴或不伴口臭的牙周炎患者的菌群結構及優勢菌差異，分析菌群和口臭之間可能的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象于2020年9月至2021年1月就診于鄭州大學第一附屬醫院牙周科的患者中隨機選取3例牙周炎伴口臭者(H組)，3例牙周炎不伴口臭者(P組)，另外選取3名健康對照者(N組)。研究對象均簽署知情同意書。

1.2 相關標準

1.2.1OLS評分標準 0表示無口臭；1分表示可疑口臭；2分表示輕微但明確的口臭；3分表示中度口臭；4分表示重度口臭，但可以忍受；5分表示惡臭。

1.2.2納入標準 受試者年齡>16歲。(1)牙周炎伴口臭患者：①口腔內來源的口臭；②OLS≥2分；③牙周探診深度(probing depth，PD)≥4 mm。(2)牙周炎不伴口臭患者：①OLS≤1分；②PD≥4 mm。(3)健康對照者：①OLS≤1分；②PD≤3 mm；③探診出血(bleeding on probing，BOP)陰性。

1.2.3排除標準 (1)開放性齲損；(2)妊娠；(3)與口干燥癥相關的全身藥物治療；(4)前3個月內接受全身抗生素治療；(5)吸煙；(6)胃食管反流；(7)全身系統性疾病，如呼吸道疾病、糖尿病、腎病、肝病、胃病、艾滋病等。

1.3 樣本采集及檢測方法受試者在采集樣本前被告知：(1)在評估前48 h勿食用含有洋蔥、大蒜類的食物；(2)采集樣本前12 h內不得飲用含有酒精的飲料；(3)檢查當天食用清淡的早餐，飯后刷牙以清除牙菌斑沉積物和食物殘渣，不清潔舌頭；(4)在進行檢查的同天早上，勿使用有香味的化妝品。取樣前對2名檢查者進行培訓并進行內部一致性檢驗，Kappa值為0.67，內部一致性較好。對口腔進行臨床檢查后，收集和制備唾液樣本。采樣時，囑受試者清水漱口后閉口呼吸30 s，然后采集3～5 mL非刺激性唾液于15 mL無菌離心管中，-80 ℃儲存，直到進一步處理。采集到牙周炎伴或不伴有口臭患者和健康對照唾液樣本共9份。進行DNA提取以及16SrRNA基因庫制備和測序。

1.4 統計學方法通過Illumina NovaSeq測序平臺完成數據統計及生物學信息學分析。首先對測序得到的原始數據進行拼接、過濾，得到有效數據，然后基于有效數據進行運算分類單位(operational taxonomic units，OTUs)聚類和物種分類分析；α、β多樣性指數組間差異分析通過Tukey和Wilcoxon秩和檢驗分析組間物種多樣性差異是否顯著。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 樣本菌種OTUs9份樣本共檢測出770個OTUs。在門水平上，主要檢測出擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、梭桿菌門、螺旋體門。在屬水平上，主要檢測出普氏菌屬、韋榮菌屬、擬桿菌屬、奈瑟菌屬、放線菌屬、嗜血桿菌屬、直腸無水桿菌屬、鏈球菌屬、梭桿菌屬、小桿菌屬。見圖1。

A為門水平樣本中豐度排名前十的微生物；B為屬水平樣本中豐度排名前十的微生物。

2.2 α多樣性分析(1)如圖2所示，3組樣本的稀釋曲線均趨于平緩，表明本實驗OTUs的測序數量足夠。3組觀測數目比較，差異無統計學意義(P>0.05)。但是N組與P組的OTUs數目較H組多。(2)通過比較Shannon指數發現，H組微生物群落多樣性高于N組(P<0.05)；P組微生物群落多樣性與N組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。(3)通過比較Simpson指數發現，H組和P組菌群多樣性大于N組，H組菌群多樣性大于P組(P<0.05)。見圖4。

圖2 樣品豐富度稀疏曲線

*P<0.05。

*P<0.05；**P<0.01。

2.3 β多樣性分析

2.3.1PCoA主成分分析 如圖5所示，N組3例樣本(N1、N2、N3)分布較為集中，而右上象限主要集中分布了P2、P3以及H3樣本，左上象限包括了H2和P1樣本，但分布較為離散，左下象限內只有H1樣本。置換多因素方差分析(ADONIS)顯示：N組與H組之間分組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；N組與P組之間分組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；P組與H組之間分組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

圖5 PCoA主成分分析

表1 ADONIS分析組間差異

2.3.2LDA Effect Size(LEfSe)分析 為了更具體地鑒定與牙周炎和口臭相關的菌群，進行了LEfSe分析，線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)得分>4分，P<0.05。3組樣品的優勢菌如圖6所示。N組嗜血桿菌屬表現出相對較高的豐度。而梭桿菌門、梭桿菌屬在H組中表現出較高的豐度。P組與N組和H組相比，未檢測到差異明顯的優勢菌群。

圖6 LDA分值柱狀圖

3 討論

目前已經通過不同的方法發現了許多與口臭有關的細菌。本研究發現，細毛菌屬的相對豐度在牙周炎伴口臭患者中更明顯，這與Takeshita等[9]發現一致。本研究中3組樣本的主要檢出菌集中在普氏菌屬、韋榮菌屬、擬桿菌屬、奈瑟菌屬、放線菌屬、鏈球菌屬、梭桿菌屬、小桿菌屬。這提示牙周炎伴口臭患者、牙周炎不伴口臭患者與健康人之間的菌群多樣性差異主要是由菌群結構不同引起的，與Riggio等[10]得出的結論相似。Riggio等[10]認為口臭與健康人菌群多樣性之間的差異是數量上的，而不是質量上的。與口臭密切相關的有小桿菌屬、梭桿菌屬、卟啉單胞菌屬、奈瑟菌屬等，而公認的VSCs的產生菌如牙齦卟啉單胞菌、梭桿菌均在牙周炎伴口臭患者中檢測到較高的豐度。其中，梭桿菌屬為牙周炎伴口臭組的優勢菌。

對舌部微生物群的細菌16SrRNA基因進行焦磷酸測序研究后發現，細毛菌屬和普氏菌屬均與高H2S水平有很強的相關性，而嗜血桿菌和孿生菌與H2S水平呈負相關[11]。本研究結果顯示，細毛菌屬和普氏菌屬在牙周炎伴口臭患者中的檢出率較高，同時嗜血桿菌在健康者和口臭及牙周炎患者的檢出豐度存在顯著差異，嗜血桿菌屬是健康組的優勢菌，與上述結論[11]相似。Takeshita等[8]發現產生高水平H2S和CH3SH的菌群結構也不相同，高H2S組梭桿菌屬、奈瑟菌屬、卟啉單胞菌屬和SR1屬的優勢明顯高于其他組，高CH3SH組普氏桿菌、韋榮菌、阿托波菌、巨型單胞菌和單胞菌的優勢明顯高于其他組。這表明不同的細菌種群參與了口腔中不同化合物的產生過程。

根據菌斑的聚集特性以及牙周狀況，將牙齦卟啉單胞菌、福賽坦菌以及齒垢密螺旋體歸為紅色復合體。該復合體與牙周炎密切相關，尤其是牙周袋的深度。在本研究中，通過16SrRNA分析在牙周炎組和口臭組中均發現了屬于紅色復合體的卟啉單胞菌屬、擬桿菌屬、螺旋體屬，以及屬于橙色復合體的奈瑟菌屬、TM7、放線菌屬和梭桿菌屬，而這些細菌的檢出率在健康組中極低。這表明牙周炎紅色復合體和橙色復合體在口臭的產生上發揮了重要作用。

借助16SrRNA技術不僅檢測到了口腔內的常見菌群，也可以檢測到一些尚不能在體外進行培養的菌群。這種高通量測序方法可以大量檢測到口腔內豐富的菌群，對口腔菌群的研究發揮了重要作用。本研究的局限性在于，未跟蹤經過牙周治療后口臭患者的口臭評分以及口內菌群的變化，而增加口臭患者前后治療對比的數據將會使本研究結果更加具有可信度。雖然樣本量較少，但納入對象均有典型的臨床體征，所以具有一定的代表性和可信度。今后會加大樣本量，進一步深入研究，以準確地了解牙周炎伴或不伴口臭患者的唾液微生物菌群多樣性以及結構的差異，分析菌群和口臭兩者的相互關系。