TRAIL單核苷酸多態(tài)性及血清sTRAIL與食管癌的關系研究*

閆曉華，劉瑞磊，高秀展，彭寶相，程振娜，徐 燕,張紀云

1.山東醫(yī)學高等專科學校醫(yī)學檢驗系，山東臨沂 276000；2.臨沂市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,山東臨沂 276000；3.臨沂市腫瘤醫(yī)院檢驗科，山東臨沂 276000

流行病學調(diào)查顯示，食管癌占所有惡性腫瘤的2%，病死率在全部惡性腫瘤中居第6位[1],我國是世界上食管癌高發(fā)的地區(qū)，其病死率居世界首位[2]。有研究表明，食管癌的發(fā)生與環(huán)境、生物、遺傳等均有關系[3]。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族成員，其可選擇性誘導腫瘤細胞、病毒感染細胞等發(fā)生凋亡，而對正常細胞無影響[4],正是由于此特性，其與腫瘤發(fā)生的關系引起研究者的關注。本研究旨在探討TRAIL基因及其血清水平與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年5月至2020年5月在臨沂市人民醫(yī)院、臨沂市腫瘤醫(yī)院就診及住院的食管癌(鱗癌)患者157例作為食管癌組。其中男101例，女56例，年齡(48.2±8.5)歲。納入標準：(1)未經(jīng)放療和化療；(2)原發(fā)性食管癌；(3)未合并心、肺、肝、腦、腎等疾病。對照組為同期體檢健康者150例，男98例，女52例，年齡(46.7±6.1)歲。兩組年齡、性別等比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。所有研究對象間無血緣關系，且簽署知情同意書，本研究符合醫(yī)學倫理學原則。

1.2儀器與試劑 全血基因組DNA提取試劑盒(Tiangen 公司)、PCR試劑(Tiangen 公司)、限制性內(nèi)切酶(Tas Ⅰ及Rsa Ⅰ，F(xiàn)ermentas公司)、紫外顯像系統(tǒng)(BIO-RAD Gel Doc XR)、核酸蛋白測定儀(Eppendorf BioPhotometer D30)、基因擴增儀(Biometra T1)、酶標儀(BIO-RAD Model 680)、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集 所有研究對象空腹采血4 mL，其中乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血2 mL,-18 ℃保存；肝素抗凝血2 mL，2 570×g離心10 min，取血清,于-18 ℃保存。

1.3.2基因組DNA的提取 按照試劑盒說明提取EDTA抗凝全血基因組DNA，產(chǎn)物通過核酸蛋白檢測儀和瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。

1.3.3PCR擴增目的基因片段 TRAIL基因引物由上海博亞公司合成，引物序列：上游引物為5′-AACATCTTCT-GTCTTTATAATC-3′,下游引物為5′-AAATAACACGTACTTACTGAAG-3′。擴增片段長度為484 bp，包含1525G/A、1588G/A、1595C/T 3個多態(tài)性位點，反應體系共50 μL。各取5 μL PCR產(chǎn)物用2.0 g/L瓊脂糖凝膠(溴化乙錠10 μg/mL)電泳，采用紫外顯像系統(tǒng)觀察DNA條帶。

1.3.4等位基因及基因型分析 (1)基因測序。由于1588位點的限制性內(nèi)切酶無法獲得，所有PCR擴增產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司測序。(2)PCR-限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)法分析：隨機抽取30份PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進行酶切分析，并與測序結果比對。用Rsa Ⅰ酶切1525位點，Tas Ⅰ酶切1595位點，酶切產(chǎn)物均用2.5 g/L瓊脂糖凝膠電泳驗證，電泳結果用紫外顯像系統(tǒng)分析。

1.3.5血清sTRAIL水平檢測 使用人TRAIL定量酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)檢測所有標本血清sTRAIL水平。

2 結 果

2.1Hardy-Weinberg平衡定律檢驗 TRAIL基因1525G/A、1588G/A、1595C/T位點等位基因型的理論分布頻率采用直接計算法，經(jīng)χ2檢驗，期望值與觀察值差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.669,P=0.716)，達到遺傳平衡，說明所選研究對象具備群體代表性。

2.2單核苷酸多態(tài)性(SNPs)分析 根據(jù)測序結果分析PCR產(chǎn)物 SNPs，并隨機抽取30例PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶酶切驗證測序結果。TRAIL基因 1525G/A位點經(jīng)Rsa Ⅰ 酶切，獲得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可形成GG基因型(473、11 bp)、GA基因型(473、286、187、11 bp)和 AA基因型(286、187、11 bp)3種電泳條帶，見圖1。TRAIL基因 1595C/T位點經(jīng) Tas Ⅰ酶切，獲得產(chǎn)物電泳可出現(xiàn) CC基因型(291、193 bp)、CT基因型(291、193、131、62 bp)和 TT基因型(291、131、62 bp)3種電泳條帶，見圖2。所選標本酶切結果與測序結果一致，同時發(fā)現(xiàn)食管癌組與對照組 1525G/A、1588G/A和1595C/T位點SNPs呈完全連鎖，為一個單體型。

2.3兩組基因型與等位基因頻率比較 食管癌組TRAIL第5外顯子的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)1525、1588、1595位點基因型和等位基因頻率與對照組比較，1525G/A、1588G/A、1595C/T基因型分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；食管癌組1525G、1588G、1595C等位基因頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組基因型與等位基因頻率比較[n(%)]

2.4根據(jù)食管癌患者病理組織學特征TRAIL SNPs分析 食管癌組TNM分期Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期1525G/A、1588G/A及1595C/T位點基因型分布比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同細胞分化程度1525G/A、1588G/A、1595C/T位點基因型分布比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 食管癌組患者不同TNM 分期及細胞分化程度TRAIL 基因型分析(n)

注：1為GG基因型；2為GA基因型；3為AA基因型;4為PCR產(chǎn)物；5為2 000 bp DNA Marker。

2.5各組血清sTRAIL水平比較 食管癌組血清sTRAIL水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；食管癌組TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期血清sTRAIL水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同細胞分化程度sTRAIL水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；食管癌組不同基因型血清sTRAIL水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

注：1為CC基因型；2為CT基因型；3為TT基因型;4為PCR產(chǎn)物；5為2 000 bp DNA Marker。

表3 各組血清sTRAIL水平比較

續(xù)表3 各組血清sTRAIL水平比較

3 討 論

TRAIL為腫瘤壞死因子超家族成員，是從人心肌的cDNA文庫中克隆出來的，人類TRAIL基因定位于3號染色體長臂2區(qū)6帶(3q26)[4]。腫瘤壞死因子是一類具有多種生物學活性的非種屬特異性細胞因子，TRAIL可通過激活凋亡途徑參與機體免疫功能調(diào)節(jié)，在腫瘤發(fā)生、轉移及自身免疫性疾病等病理過程中發(fā)揮重要作用[5-6]。TRAIL有5種受體，分別稱為TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、TRAIL-R3(DcR1)、TRAIL-R4(DcR2)、TRAIL-R5(OPG)，前4種受體為細胞膜結合受體，OPG為細胞外分泌性受體。DR4和DR5的細胞質(zhì)區(qū)含有死亡結構域，能傳遞死亡信號，誘導細胞凋亡。DcR1、DcR2為膜誘騙受體，OPG是一種可溶性誘騙受體，這3種受體沒有功能性的死亡結構域，不誘導細胞凋亡[7]。TRAIL與TRAIL受體存在于人體多種組織，TRAIL是否誘導細胞凋亡取決于不同途徑介導與何種受體的結合。細胞凋亡是維持機體組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個重要過程，在腫瘤發(fā)生機制中起一定作用[5-8]。近年來，TRAIL與食管癌的研究取得了很大進展,包括TRAIL誘導[9]、TRAIL聯(lián)合藥物誘導食管癌細胞凋亡的研究[10-11]。有關食管癌遺傳易感性的研究也有很多,如XPA、GSTP1、轉化生長因子β1、環(huán)氧合酶-2、醇脫氫酶-2、Fas/FasL等基因與食管癌的相關性研究[12-16]。

本研究結果顯示，TRAIL基因的第5個外顯子3′UTR 1525G/A、1588G/A、1595C/T位點 SNPs分析，測序結果與PCR-RFLP結果一致。本研究結果發(fā)現(xiàn)，食管癌組TRAIL基因第5外顯子3′UTR 1525G/A、1588G/A、1595C/T基因型分布與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；食管癌組1525G/1588G/1595C等位基因頻率明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TRAIL基因3′UTR攜帶1525G/1588G/1595C基因時，TRAIL蛋白表達量下降，或者由此基因調(diào)控生成的TRAIL蛋白與受體DR4、DR5結合誘導腫瘤細胞凋亡的能力下降，從而導致腫瘤發(fā)生率升高。本研究結果還顯示，食管癌組血清sTRAIL水平明顯低于對照組，食管癌組按照基因型分組1525GG/1588GG/1595CC 血清sTRAIL水平低于1525AA/1588AA/1595TT水平，這與任秀花等[17]報道的食管浸潤癌組織TRAIL蛋白呈低表達的結論一致。有研究顯示，食管癌組根據(jù)腫瘤TNM分期，Ⅲ～Ⅳ期血清sTRAIL水平明顯低于Ⅰ～Ⅱ期血清sTRAIL水平，此結果提示血清sTRAIL水平與食管癌的進展與預后是有關系的。通過對所選標本基因型分析，筆者發(fā)現(xiàn)TRAIL基因(1525G/A、1588G/A、1595C/T)呈完全連鎖遺傳，這與本課題組前期的研究結果一致[5]，也與蔣益等[18]的研究結果一致。本研究顯示，食管癌組患者不同TNM分期TRAIL基因型分布及血清sTRAIL水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；食管癌組患者不同細胞分化程度TRAIL基因型分布及等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，此結論與本研究預先推測結論有一定差異，這可能與本研究樣本量較小及地域限制有關，需要后期擴大地域范圍、補充樣本量繼續(xù)分析。

綜上所述，TRAIL與食管癌的發(fā)生、發(fā)展有一定相關性。中國人TRAIL基因的第5外顯子3′UTR存在食管癌的易感基因型，食管癌患者血清sTRAIL表達水平較健康人降低Ⅲ～Ⅳ期患者血清sTRAIL水平明顯低于Ⅰ～Ⅱ期。