生肌玉紅膏對大鼠糖尿病足潰瘍組織bFGF、HIF-1α 及VEGF 表達的影響*

陳盛業，甘 宇

沈陽市第七人民醫院，遼寧 沈陽110032

糖尿病足（diabetic foot，DF）又稱為糖尿病性肢端壞疽，是由糖尿病外周血管病變和（或）神經病變感染等因素造成足或下肢組織破壞的一種病變［1］。有研究指出［2］，發生足潰瘍或壞疽的糖尿病患者達15%以上，糖尿病足部潰瘍是85%的糖尿病患者截肢的主要原因，嚴重影響患者生活質量。血管基底膜增厚、內皮損傷、血液高黏滯綜合征表現、微循環障礙等是形成糖尿病足的主要病理基礎［3］，而血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）作為促血管生成的主要因子，能夠促進血管生成及修復，改善微循環，從而加快糖尿病足潰瘍的愈合。低氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在缺氧條件下能調控VEGF 轉錄來控制VEGF 表達程度。生肌玉紅膏能促進糖尿病足潰瘍創面愈合，達到解毒生肌效果。本研究通過建立糖尿病足大鼠模型探討生肌玉紅膏對糖尿病足創面局部組織中VEGF、HIF-1α 及bFGF 表達的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物清潔級成年SD大鼠60只，雄性，體質量200～250 g，由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：LNZY遼2017030。

1.2 主要試劑與儀器生肌玉紅膏源自《外科正宗》，藥物組成：當歸、白芷、紫草、血竭、甘草、輕粉、麻油（所有藥物由遼寧中醫藥大學附屬醫院制劑室制備，采用適量基質調制成膏劑，外敷創面使用）。凡士林紗布由遼寧中醫藥大學附屬醫院提供。 鏈脲佐菌素STZ（美國Sigma 公司，批號：B01106002，規格：1 g）；無菌枸櫞酸緩沖液（北京化工廠，批號：20080429）；酶聯免疫檢測儀、MK3（芬蘭雷勃公司）；bFGF（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：sc-79，規格：48T）、HIF-1α（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：BKE9281，規格48T）、VEGF 酶聯免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：CYT-241，規格96T）。

1.3 動物造模與分組60只雄性SD大鼠用高脂飼料喂養，2 周后禁食（不禁水）16 h，一次性腹腔注射STZ 50 mg/kg（用pH 4.4 的無菌枸櫞酸緩沖液配成0.25% 濃度）；72 h 后斷尾取血，測定血糖，血糖＞12 mmol/L者為糖尿病大鼠，將糖尿病大鼠隨機分為對照組、實驗組各25 只。兩組動物空腹8 h 后均以10% 水合氯醛1 mL/100 g（體質量）腹腔注射麻醉，足背部剃毛，常規消毒，用打孔器于大鼠雙足足背部相同部位打孔，形成機械性全層皮膚圓形創面，直徑為2 mm，潰瘍深及筋膜層，止血后以無菌紗布包扎，分籠飼養，自由飲水，普通飼料喂養。

1.4 實驗方法造模后實驗組大鼠足局部創面予與創面等面積的生肌玉紅膏油紗布覆蓋，對照組創面覆蓋凡士林紗布，隔日更換敷料，連續用藥14天。分別于造模后3、7、14天處死大鼠，距創緣0.1 cm 取材，固定于福爾馬林中，常規脫水，石蠟包埋，沿創面最大截面切片，免疫組化法檢測大鼠足局部創面組織中bFGF、HIF-1α及VEGF表達。

1.5 bFGF、HIF-1α 及VEGF 含量測定石蠟切片常規脫蠟，微波抗原修復，加3% H2O2去離子水3 mL，孵育5～10 min 阻斷內源性過氧化物酶，PBS 沖洗，3 min×3 次，滴加封閉，用正常山羊血清工作液3 mL，室溫孵育10～15 min，傾去，滴加適當比例稀釋的一抗（bFGF、HIF-1α、VEGF），4℃過夜，室溫30～60 min，PBS 沖洗3 min×3 次，滴加生物素標記山羊抗大鼠Ig G，37℃孵育10～15 min，PBS沖洗3 min×3 次，滴加辣根標記鏈霉卵蛋白工作液3 mL，37℃孵育10～15 min，應用DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，脫水，封片。高倍鏡下（200 倍）由兩名觀察者采用雙盲法對各組標本每個切片隨機選取5 個視野，計數陽性細胞數及總細胞數，計算陽性細胞率。

1.6 陽性判定標準bFGF 免疫組化標記定位于細胞漿，細胞漿著色呈棕黃色為陽性細胞。HIF-1α蛋白表達以細胞核或胞質內有棕黃色顆粒為陽性，VEGF 陽性表達以細胞質或細胞膜中有棕色或深黃色顆粒狀為陽性，細胞無著色為陰性。陽性細胞數＜10%為陰性（-），＞10%為陽性（+）。

1.7 統計學方法采用SPSS 21.0 統計軟件分析數據，計量資料以xˉ±s表示，樣本均數間比較用單因素方差分析，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 bFGF 表達情況干預后bFGF 表達兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；第7天bFGF表達兩組均升高，實驗組bFGF表達高于對照組（P＜0.05）；第14天bFGF表達進一步下降，兩組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組大鼠不同干預時間點bFGF表達陽性計數（±s）

表1 兩組大鼠不同干預時間點bFGF表達陽性計數（±s）

注：與對照組比較，*表示P＜0.05

組別對照組實驗組鼠數25 25 3 d 16.7±4.8 22.6±5.2*7 d 22.5±3.5 30.6±6.1*14 d 10.0±3.8 6.4±3.7*

2.2 HIF-1α 表達情況干預第3 天HIF-1α表達兩組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；第7 天HIF-1α表達兩組均升高，實驗組高于對照組（P＜0.05）；第14 天HIF-1α表達下降，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組大鼠不同干預時間點HIF-1α表達陽性計數（-x±s）

2.3 VEGF 表達情況第3 天，實驗組VEGF 水平升高較對照組明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）；第7天，VEGF表達量繼續升高，實驗組高于對照組（P＜0.05），兩組間差異顯著；第14 天，兩組VEGF的表達量下降，實驗組低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組大鼠不同時間點VEGF表達陽性計數（-x±s）

3 討論

糖尿病足為慢性進行性疾病，西醫雖能根治，但耗費巨大。糖尿病足屬中醫“消渴脫疽”范疇，多因瘀熱邪毒凝滯經絡導致氣血運行不暢，肌膚失養所致，臨床常用生肌玉紅膏祛腐生肌，潤膚止痛。方中當歸、血竭活血養血，祛腐生肌，斂瘡止痛；輕粉、紫草、甘草清熱解毒，涼血祛腐；白芷辛溫通竅，潰膿止痛；麻油滋潤肌膚，調和諸藥。藥膏外敷滲透力強，能刺激毛細血管生成及擴張，增加創面營養和血供使得肉芽組織中血管擴張，促進血液循環及組織供氧，加速創面修復愈合［4］。

糖尿病足的慢性創傷，特點是慢性缺氧，炎癥和生長因子分泌不足［5］。HIF-1 是細胞為了適應缺氧環境而產生的具有轉錄活性的轉錄因子，HIF-1α是HIF-1的調節亞基，氧氣通過調節HIF-1α來調節HIF-1 的活性，因此HIF-1α的表達可以間接反映組織缺氧情況，內皮細胞增殖或損傷導致血管周圍相對氧缺乏時，HIF-1α陽性表達升高。HIF-1α又可促使VEGF 轉錄激活，上調VEGF 表達并且增加VEGF mRNA 穩定性，從而促使血管生成。本研究結果顯示，兩組HIF-1α先高表達，后逐漸下降，兩組比較差異明顯。雖然敷料能夠使創傷部位血管周圍缺氧程度加重引起HIF-1α表達增加，但本實驗結果提示生肌玉紅膏能使大鼠糖尿病足潰瘍組織HIF-1α表達升高，組織缺氧加重，表明實驗組產生大量HIF-1α來促使VEGF 表達，加快血管生成修復。HIF-1α表達逐漸下降說明組織缺氧程度改善，而且創面修復愈合速度較前逐漸減慢，以產生瘢痕。

血管生成由生長因子和受損組織中受損細胞分泌的細胞因子協同作用［5］。VEGF作為促進血管生成的主要刺激因子，是傷口愈合的主要生長因子之一。有研究指出［6］，VEGF 表達活躍期主要集中在創面發生后的4～8 天；而DF 傷口愈合表現為VEGF 表達延遲，血管生成延緩，表皮細胞再生障礙。提高VEGF 水平能特異性引起血管內皮細胞分裂增殖、血管通透性增加，促進內皮細胞、單核細胞遷移及誘導血管生成［7］。通過血管壁重塑和融合逐漸形成具有功能的側支動脈循環，重建缺血組織血流供應。VEGF 在維持和恢復內皮細胞完整性中發揮關鍵作用，可防止毛細血管丟失，保護內皮細胞不致發生程序性死亡，還可通過一氧化氮產生舒張血管平滑肌細胞，促使血流恢復，增加側枝循環血量，進而起到保護作用［8］。本研究實驗組VEGF 表達于第3、7 天升高，第14 天下降，但均高于對照組。其原因可能是生肌玉紅膏促進HIF-1α的表達進而增加VEGF 表達，亦或直接提高VEGF 水平以增加血管通透性，促進細胞遷移及再生，誘導新血管生成。后期生成的血管逐漸改善了潰瘍組織血供及營養，緩解了組織缺血、缺氧情況，因此HIF-1α表達下降進而使VEGF 表達下降。

bFGF 是一種多功能細胞生長因子，能夠趨化炎癥細胞、成纖維細胞等修復細胞向創面聚集，導致修復細胞大量增殖，bFGF 表達增加可上調組織修復細胞上生長因子受體活性，激活細胞增殖和肉芽組織生長，改善局部抗感染能力和營養狀況［7］。姚昶等［9］研究證明在創面修復的炎癥和增殖期，生肌玉紅膏可增加bFGF 水平，促進創面膠原合成和上皮生長；塑形期bFGF 水平降低能促進過度增生膠原降解，使其排列有序，減少瘢痕形成。生肌玉紅膏外用可促進創面微循環，減少微血栓，因此增加創面營養和血供，促進創面愈合。進一步證實了［10］生肌玉紅膏促進創面修復，可能是通過調節創面肉芽組織中成纖維細胞生長因子bFGF 介導。總之，生肌玉紅膏可改善創面微循環，促進創面愈合，其機制之一可能為調節創面肉芽組織內bFGF 含量。另外，王曉媛等［11］證明外用中藥可上調局部組織bFGF 表達，促進瘡瘍局部血管生成和肉芽組織生長，改善局部營養狀況，促進創面修復，達到治療DF 的目的。本實驗中敷有生肌玉紅膏的bFGF 表達量高于敷有凡士林紗布的對照組，隨著時間的延長，bFGF 表達量降低，但仍高于對照組。bFGF 表達水平的升高，提示著生肌玉紅膏促進細胞增殖和肉芽組織生長，促進創面愈合。隨著創面的逐漸修復，bFGF表達逐漸下降，既能繼續修復創面細胞，增加創面營養和血供，又可防止瘢痕形成。

本實驗采用高脂飼料結合STZ 建立的糖尿病模型與人類2 型糖尿病的發病機制相近，長期高脂飲食誘發的高血糖狀態出現的2 型糖尿病符合臨床實際［12］。應用打孔法制備糖尿病足大鼠模型，縮短了模型建立周期，確保創口部位、大小的相似性，以增加模型穩定性。不足之處是打孔法造成的足潰瘍與臨床糖尿病足自然發展為潰瘍的過程不同，另外生肌玉紅膏中輕粉雖然有提毒祛腐的作用，卻在曝光或與水共煮條件下易分解而生成氯化汞及金屬汞，長期應用易導致蓄積中毒，用藥后局部紅腫、瘙癢等不良反應多由此引起［13］。因此，是否需要去輕粉還有待進一步研究。

綜上所述，生肌玉紅膏在治療糖尿病足過程中能促進bFGF、HIF-1α及VEGF 表達，初期及中期能促進細胞增殖，加快肉芽組織生長，促進局部血管生成，以恢復血供。后期，3 個因子表達均有下降但仍然高于對照組，顯示其可繼續促進創面的修復及愈合，改善組織缺氧狀態及營養狀況，還能防止瘢痕形成。