微孔板篩選釀酒酵母乙醇發酵相關性狀的因素探究

余鴻飛，姜嬌,2，董琦楠，黃蓉，商華，葉冬青,4*，劉延琳,2*

1(西北農林科技大學 葡萄酒學院，陜西 楊凌，712100)2(中國葡萄酒產業技術研究院，寧夏 銀川，750021) 3(中糧長城葡萄酒(寧夏)有限公司，寧夏 永寧，750100) 4(廣西壯族自治區農業科學研究院農產品加工研究所，廣西 南寧，530007)

針對目標產物選育具有突出性狀的釀酒酵母是生產優質葡萄酒重要的基礎和關鍵[1]，其中乙醇和甘油分別為釀酒酵母乙醇發酵的主產物和主要副產物，是葡萄酒釀酒酵母選育最重要的性狀之一[2]，二者的產量常受酵母的生長及發酵過程中產生的有機酸的影響[3-4]。近年來對優良釀酒酵母篩選的研究較為豐富，目前常用的方法仍為錐形瓶篩選，其設備要求簡便、操作難度低。然而隨著對優良釀酒酵母需求的日益增加，錐形瓶篩選費時費力、成本較高等固有缺陷逐漸成為制約菌株篩選效率的一大瓶頸[5]。因此，亟需通過高通量篩選技術如微孔板(microtiter plates，MTP)培養、微規模生物反應器，并行發酵系統等方式縮短菌株篩選時間[6-7]。

基于MTP的高通量篩選高效快速等特點，廣泛應用于細胞篩選領域。已有的研究表明，MTP與錐形瓶2種模型在細胞的培養、生長代謝檢測等方面具有高度一致性[8-9]，且基于MTP的全自動細胞篩選裝置的開發極大地提升了篩選效率，為傳統的基于錐形瓶發酵的檢測方法提供了一種互補性的篩選方案[10]。在酵母的相關研究中，基于MTP的試驗方法也開始引發研究者的關注。LICCIOLI等[11]證明釀酒酵母的MTP發酵與自身誘導的錐形瓶厭氧發酵在甘油與乙酸酯產量上具有一致性。程艷等[12]使用96孔板培養釀酒酵母菌株，并聯用HPLC檢測發酵液，成功篩選出低產尿素的釀酒酵母。與此同時，酵母的MTP篩選也暴露出一定問題，例如MTP發酵體積較小，實時監控發酵難度更大[13]，且縮小的體系更易受外界環境影響，對實驗精度的要求更高[14]。已有的研究表明，靜置發酵過程中，溶氧會影響酵母的代謝路徑，最終會導致產物含量的巨大差異[15]，且MTP有限通氣的情況下釀酒酵母生長較慢，但有助于延緩酵母老化[16]，因此設計實驗方案時需加以慎重考慮。

基于上述原因，本研究選擇乙醇、甘油、殘糖作為釀酒酵母MTP篩選條件的衡量指標，通過與傳統錐形瓶靜置發酵進行對比，首先探究了乙醇發酵產物MTP篩選的最佳條件，隨后通過差異性檢驗、聚類分析及多因素方差分析探究了菌株、裝液量及覆膜情況對釀酒酵母相關性狀篩選的影響。為建立適用于釀酒酵母的快速篩選方法、推動本土微生物資源的開發與利用、加快產業的發展提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

選取不同遺傳背景，發酵能力有差異的釀酒酵母單倍體N2、N3、N5、N7、N10、L9、L12及L13作為不同發酵能力的菌株代表，用以測定不同條件MTP篩選與錐形瓶篩選的差異。所選單倍體均源自西北農林科技大學葡萄酒學院微生物種質資源室。

1.2 試劑及儀器

MJX智能霉菌培養箱，寧波江南儀器廠；Y15全自動葡萄酒檢測儀，西班牙Biosystems公司；生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；Elx800酶標儀，美國BioTek公司；微孔板，美國Costar公司；SF-300微透氧封板膜、SF-501封板膜，北京BioTss公司；液相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司。

酵母基礎培養基(yeast extract protein dextrose，YEPD)[17]：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，固體培養基中加入2%瓊脂。

MS300培養基：參照BELY等[18]的配方，調整含糖量為350 g/L，其中葡萄糖與果糖的質量比為1∶1。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母種子液制備

取-80 ℃冰箱保藏的甘油管凍存菌株，于YEPD固體培養基上劃線，挑取形態整齊的單菌落轉接于50 mL YEPD液體培養基中，28 ℃、150 r/min培養24 h制備種子液。對制備的種子液進行血球板計數，以5×105cells/mL接種至不同發酵方案組使用的MS300模擬汁。

1.3.2 發酵方案

使用150 mL錐形瓶(erlenmeyer flask fermentation，EF)100 mL裝液量、24孔板2 mL及1 mL裝液量、48孔板0.5 mL裝液量及96孔板0.2 mL裝液量，進行不同裝液量的MTP發酵試驗。由于不同溶氧濃度對乙醇發酵的終產物有重要的影響，實驗使用了2種不同氧氣通透性的MTP封板膜：其中SF-300密封膜為醫用透氣性微孔軟膜，可實現二氧化碳和氧氣的自由交換，阻止水蒸氣蒸發，發酵環境視為微透氧環境(microaerobic fermentation，MF)；而SF-501密封膜為非滲透性軟膜，不具有氣體通透性，可完全阻隔發酵過程中MTP內外的物質交換，其發酵環境視為嚴格厭氧(anaerobic fermentation，AF)。9組實驗處理均使用MS300模擬汁，于25 ℃條件下靜置發酵，每組3個生物學重復。

1.3.3 理化指標檢測

待發酵液殘糖含量近乎停止下降時視為發酵停滯，取剩余發酵液12 000 r/min離心5 min取上清液，于-20 ℃冰箱凍存待檢。理化指標檢測前使用蒸餾水將發酵液稀釋至目標產物檢測范圍內。使用3，5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)比色法進行殘糖檢測[19]；參考杜青等[20]的方法，使用生物傳感分析儀對樣品進行乙醇含量測定；使用Y15全自動葡萄酒分析儀及配套的甘油檢測試劑盒(GPO-POD法)進行甘油含量檢測；參考WANG等[21]的方法使用HPLC進行有機酸含量檢測。

1.4 數據分析

使用Excel 2016進行理化指標的數據處理，使用SPSS 20.0軟件進行顯著性分析及多因素方差分析(P<0.05表示具有統計學意義)，使用R 3.5.0及Graphpad Prism 8.0繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 不同發酵體系對釀酒酵母產乙醇和甘油性狀影響

首先以錐形瓶靜置組(EF-100)為參照，探究了不同的MTP篩選體系(MF-2MTP、MF-1MTP、MF-0.5MTP、MF-0.2MTP、AF-2MTP、AF-1MTP、AF-0.5MTP、AF-0.2MTP)對菌株乙醇發酵的影響。不同發酵體系對主要物質(乙醇、甘油、殘糖)產量具有極顯著的影響(圖1)，絕大部分MTP發酵條件與錐形瓶靜置篩選結果具有較大差異，且這一現象在不同菌株的發酵產物中均普遍存在。綜合對比各菌株篩選結果可知，使用嚴格厭氧覆膜的實驗組(AF)與錐形瓶組(EF)在殘糖、乙醇、甘油含量上更為接近，且均與使用透氧性覆膜的實驗組(MF)具有較大差異。MF組發酵產物符合釀酒酵母的有氧發酵模式，其產物中的殘糖和乙醇含量更低，甘油含量更高，該發酵方式的主要目的往往是收集酵母菌體。而在實際生產中則主要依靠釀酒酵母的厭氧發酵模式以產生乙醇，因此在酵母篩選過程中也需貼近實際應用環境進行篩選，使用與錐形瓶靜置發酵更為接近的AF組作為篩選條件更為適宜。若不考慮篩選條件對終產物的影響，采用未經優化的MTP篩選方案，其結果可能與傳統的錐形瓶靜置篩選具有很大出入，對后續研究造成影響。

A-乙醇；B-甘油；C-殘糖圖1 不同菌株發酵液中乙醇、甘油和殘糖的含量Fig.1 Content of ethanol, glycerol l and sugar in the fermented broth produced/consumed by each strain

2.2 MTP替代錐形瓶篩選釀酒酵母產乙醇和甘油性狀效果的評估

為找出篩選效果與錐形瓶最為接近的MTP篩選條件，本研究首先將各組MTP發酵條件下不同菌株同一產物的含量視為一組數據，對其離散程度進行了比較，并對其均值進行差異性檢驗。隨后通過比較錐形瓶與最優替代條件下不同產物的菌株排序，對該最優條件的實際替代效果進行評價。

綜合對比EF組與各MTP組篩選結果可知，EF-100組與AF-2MTP、AF-1MTP、AF-0.5MTP間在乙醇、甘油、乙酸的平均值間不存在顯著差異。其中AF-2MTP(24孔板，完全厭氧覆膜，2 mL裝液量)組的發酵產物含量及菌株間離散程度與EF-100組最為接近。對二者進行不同產物的菌株排序，結果證明AF-2MTP具有在以產乙醇、甘油能力為目標的釀酒酵母篩選中替代錐形瓶篩選的良好潛力(數據未列出)。但在本實驗條件下仍無法達到完美替代錐形瓶靜置篩選殘糖及乙酸的效果。同時由于乙酸產量較低，揮發性強，感官閾值低等特性，需根據其產物特征進一步優化篩選條件，提高檢測精度，方可應用于以產乙酸能力為目標的釀酒酵母篩選。

EF與AF組的乙醇含量顯著高于有氧發酵的MF組：AF-2MTP組乙醇平均值最高，為11.34%(體積分數)，MF-0.5MTP組乙醇平均值最低，為1.94%(體積分數)(圖2-A)。甘油產量與乙醇產量呈負相關：EF與AF組的甘油產量接近，均顯著低于MF組，且EF組與AF組內菌株間差異較小，均小于MF組。MF-0.5MTP組甘油平均值最高，為26.42 g/L，AF-2MTP組甘油平均值最低，為9.43 g/L(圖2-B)。MF組殘糖相較于EF與AF組更低，發酵更為徹底。EF-100組殘糖平均值最高，為55.11 g/L，MF-0.2MTP組殘糖平均值最低，為17.41 g/L(圖2-C)。MF組部分菌株的殘糖與其他菌株間均存在較大差異，這可能是有氧發酵過程中菌株間滲透壓耐受性差異所導致的。EF組乙酸產量低于MF組與大部分AF組，且EF組與AF組間差異較小，MF組間菌株差異較大。MF-0.5MTP組乙酸平均值最高，為7.58 g/L，EF-100組乙酸平均值最低，為0.95 g/L(圖2-D)。整體而言，MF組間發酵產物含量差異巨大，這可能與含氧量對釀酒酵母生長代謝的影響有關。根據譚俊[13]的研究，篩選過程中使用的MTP類型與裝液量會影響篩選體系的氣體交換速率，因此各MF組間含氧量可能存在一定差異，而釀酒酵母菌株在不同含氧量條件下的生長代謝水平差異顯著，并最終導致了MF組間巨大的代謝物差異。

A-乙醇；B-甘油；C-殘糖；D-乙酸圖2 不同處理中乙醇、甘油、殘糖和乙酸均值比較Fig.2 Mean values of ethanol, glycerol, sugar and acetic acid in the fermented broth under different treatments注：不同小寫字母表示顯著(P<0.05)

大多數MTP組離散程度較錐形瓶組更大，體現出MTP篩選發酵液體積少，易受到外界影響的特點。這與周劍等[22]篩選高產Rakicidin B1的海洋小單孢菌時得出的結論具有一致性。因此基于MTP的菌株篩選更適合應用于初篩階段，并通過優化篩選條件，聯用高通量檢測設備，增加生物學重復數量等方式優化篩選效果[23-24]。

2.3 影響終產物含量的主要因素探究

為探究微孔板篩選過程中的主要影響因素，即覆膜條件，裝液量和菌株特異性對發酵終產物的影響，使用R對發酵產物進行聚類分析并繪制熱圖(圖3)。由聚類樹及色條分布情況可知，覆膜是影響聚類的最顯著因素，其次為不同裝液量，且二者較菌株特異性的影響更為明顯。MF組在發酵結果上極顯著區別于EF組和AF組，其發酵產物含有更低的殘糖、乙醇和更高的甘油、乙酸，發酵的狀況接近于有氧發酵。這表明使用MTP體系進行釀酒酵母篩選時，應慎重考慮覆膜對發酵結果的影響，以免遮蓋菌株特異性而造成結果差異。裝液量也會對發酵結果產生顯著影響，且隨著裝液量的減少系統的不穩定性也隨之增大[25]。為了確保結果的準確性，可視具體情況增加生物學重復[24]。不難發現，乙醇和甘油產量間呈現明顯的負相關，這與二者同為釀酒酵母碳代謝產物，在通路上存在底物競爭有關。隨著通氧量的加大，發酵結果的甘油產量顯著提高，同時伴隨著乙醇產量的下降，這與目前普遍的研究結果一致[26]。

由于發酵液中的有機酸也會隨乙醇發酵的進行不斷積累，逐漸對釀酒酵母細胞產生脅迫[27]，影響其正常的生理活動，并最終影響終產物中乙醇和甘油的最大累積量。為更全面的探究覆膜、裝液量對乙醇發酵終產物的影響，我們還檢測了不同實驗組的主要有機酸含量，如圖3所示。終產物中檸檬酸，琥珀酸及乙酸含量與覆膜顯著相關：與EF組相比，AF組發酵結果的有機酸含量與EF組差異較小，除乙酸外其他有機酸不存在顯著差異；而MF組的檸檬酸，琥珀酸及乙酸含量均有所增加，而蘋果酸產量略有下降。由于檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸均為三羧酸循環的中間產物，這樣的結果差異或許是不同覆膜條件下糖酵解及三羧酸循環代謝、氧化還原平衡差異的直觀體現。高氧化還原電位下有氧呼吸途徑具有較強的活性，糖酵解及三羧酸循環途徑活躍，從而產生較多的還原型輔酶。在有氧條件下，累積的還原型輔酶可以通過甘油途徑及多種其他途徑重新氧化，從而造成了甘油及多種有機酸的產量增加[28]。此外，發酵液溶氧水平的升高也提升了釀酒酵母的綜合耐受能力，包括對有機酸毒性的耐受極限[27]，客觀上促進了終產物有機酸含量的增加[29]。這一結果反映出MTP發酵的覆膜選擇對實驗結果的決定性作用，若使用MTP體系取代錐形瓶作為菌株篩選的主要方式，則須針對二者不同的通氧特性進行覆膜優化，保證實驗結果的準確性。

圖3 終產物聚類分析Fig.3 Clustering analysis of the main final products

為探尋菌株、覆膜、裝液量之間可能存在相互作用，本研究還對三者進行了多因素方差分析(表1)。結果表明殘糖、乙醇、蘋果酸及琥珀酸受菌株差異性的顯著影響；覆膜條件對除蘋果酸外的關鍵物質影響顯著；裝液量對除殘糖、蘋果酸外的關鍵物質均有顯著影響。此外菌株與覆膜在蘋果酸產量存在顯著交互作用，裝液量與覆膜在乙醇、甘油、檸檬酸、琥珀酸產量存在顯著交互作用，菌株與裝液量間不存在交互作用。該分析結果與熱圖呈現出一致的趨勢，即覆膜>裝液量>菌株特異性。

表1 菌株、覆膜、裝液量間多因素方差分析Table 1 Analysis of the association between strains, coating membranes, and culture volumes via MANOVA

3 結論與討論

本研究對8株菌株9種發酵體系的發酵結果進行綜合分析發現，乙醇發酵中不同發酵體系對主要物質產量具有極顯著影響。主要影響因素排序為覆膜>裝液量>菌株。覆膜對乙醇發酵的殘糖、乙醇、甘油及部分有機酸產量均具有極顯著影響，裝液量對乙醇及甘油產量及部分有機酸具有顯著影響，菌株對乙醇及蘋果酸產量影響顯著。同時覆膜及裝液量間存在著一定的相關關系。以錐形瓶靜置發酵結果為參照和各組MTP發酵結果進行了兩兩比較，結果表明24孔板、完全厭氧覆膜、2 mL裝液量實驗組(AF-2MTP)在各個維度上與錐形瓶靜置實驗組(EF)均不存在顯著差異，且在應用于乙醇及甘油產量篩選時效果良好。

優化MTP發酵條件以代替傳統的錐形瓶發酵為高效進行菌株篩選提供了新的思路，但其依然存在局限性。本實驗中優化的方案可以較好滿足釀酒酵母在乙醇和甘油產量篩選方面的需求，但若要更深入的篩選其他發酵產物如殘糖、揮發酸、香氣物質等，仍需進行針對性的調整。