基于UPLC-Q-TOF-MS技術分析原料乳冷藏 過程中脂類代謝組學

李璞鈺，劇 檸，羅玉龍，王媛媛，茍 萌

（寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

原料乳富含多種天然成分，易被微生物分解利用。在多數國家中，原料乳擠出后并不立即加工，需進行冷藏，整個過程可能長達6～7 d[1-2]。4 ℃冷藏可有效抑制微生物生長，降低生化反應速率，減緩原料乳品質劣變。但隨冷藏期的延長，原料乳仍會發生脂類氧化、蛋白質變性等多種化學反應，從而造成酸度、黏度的增加及絮狀物的出現，最終導致原料乳腐敗[3]。其原因與原料乳中微生物特別是嗜冷微生物的種類和數量密不可分[4-6]，課題組前期對4 ℃冷藏7 d的原料乳菌群數量及多樣性展開研究，發現冷藏3 d和6 d時微生物菌群構成較之前發生了顯著改變。冷藏3 d優勢菌群從不動桿菌、鏈球菌、梭菌屬向假單胞菌、黃桿菌屬演替，冷藏6 d優勢菌群又轉變為不動桿菌及乳球菌屬；而原料乳冷藏2 d和5 d菌群變化趨勢不顯著[7-8]。菌群多樣性的復雜變化決定了乳代謝物逐步改變直至原料乳宏觀的品質劣變，無法用于加工。

非靶向代謝組學是檢測生物體整體水平代謝特征的組學技術應用，通過使用大規模、高通量技術對涉及樣品的內源性代謝物進行全局性分析，盡可能多地定性和相對定量生物體系中的代謝物[9-10]。超高效液相色譜-四極桿串聯飛行時間質譜（ultra-high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）技術相較于其他代謝組學檢測技術，在峰容量、靈敏度、分辨率、分析速度上具有絕對優勢。其適合檢測含有極為復雜的小分子質量代謝物體系的樣品，是目前國內外使用較為普遍的分析檢測手段，被廣泛應用于乳品質量、安全及加工等方面研究。針對原料乳，多項研究依靠該技術剖析不同母體、飼養方式、貯藏條件下乳代謝物差異[11-12]，其結果為乳品質改善提供了研究基礎。但隨冷藏時間的延長，原料乳中代謝物必定發生變化影響乳品質，最終導致原料乳的腐敗變質，但其變化情況卻鮮有報道。本研究基于該技術對4 ℃冷藏過程中原料乳復雜的代謝物體系進行定性定量分析。通過正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）方法，將不同冷藏時間原料乳代謝產物的種類進行歸納，總結冷藏階段乳代謝產物的分布變化情況。結合T檢驗重點篩選脂類顯著性差異代謝物并分析其相關通路，探討冷藏階段乳脂類代謝的變化規律及相關機理，以期為原料乳保藏及乳制品加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳樣品（體細胞數小于2×105個/mL，菌落總數小于1×104CFU/mL，蛋白質質量濃度大于3.0 g/100 mL）來自于寧夏銀川當地乳品廠。采集過程嚴格遵循無菌操作，樣品采集后將采樣瓶迅速裝入含冰袋的隔熱包中放置，并于2 h內運回實驗室置于4 ℃冷藏。根據前期微生物多樣性分析及細菌計數結果，選取菌群變化顯著的時間點，即0、1、3、4、6 d進行乳代謝分析。分組編號為B0、B1、B3、B4、B6，每組樣本做6 個平行。其中B1 vs B0、B3 vs B1、B4 vs B3、B6 vs B4表示不同冷藏時間原料乳樣品的對比組。

乙醇（純度95%） 國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純） 德國Merck公司；乙酸銨、氨水（均為色譜純） 德國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

1290 Infinity LC UPLC儀 美國Agilent公司；Triple TOF 5600/6600質譜儀 美國AB SCIEX公司；ACQUITY UPLC?BEH C18液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；5430R型低溫高速離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 質控樣本的制備

樣品等量混合制備質控（quality control，QC）樣本。QC樣本用于測定進樣前儀器狀態及平衡色譜-質譜系統，監測和評價系統的穩定性及實驗數據的可靠性。

1.3.2 樣品預處理

在－80 ℃取出樣本，4 ℃緩慢溶解后分別取各組樣本100 μL，加入400 μL預冷的甲醇-乙腈（1∶1）溶液，渦旋60 s，－20 ℃放置1 h沉淀蛋白，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，取上清液冷凍干燥，－80 ℃保存樣本。

1.3.3 色譜條件

采用1290 Infinity LC UPLC系統，HILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）對樣品進行分離，柱溫25 ℃，流速0.3 mL/min，流動相A由水、25 mmol/L乙酸銨及25 mmol/L氨水組成，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，5% A，95% B；0.5～7 min，5%～35% A，95%～65% B；7～8 min，35%～60% A，65%～40% B；8～9 min，60% A，40% B；9～9.1 min，60%～5% A，40%～95% B，9.1～12 min，5% A，95% B。

1.3.4 質譜條件

分別采用電噴霧離子源，正負離子模式進行檢測。樣本采用AB Triple TOF 6600質譜儀對代謝物進行鑒定。霧化氣壓1為40 psi，輔助氣壓2為80 psi，氣簾氣壓力為30 psi，離子源溫度為650 ℃，噴霧電壓（ISV9F）為±5 000 V（正負2 種模式）；二級質譜采用數據依賴型掃描（information dependent acquisition，IDA）獲得，并且采用高靈敏模式，去簇電壓為±60 V（正負2 種模式），碰撞電壓為（35±15）eV，IDA設置如下：除排同位素4 Da，每周期要監測的候選離子：10。

1.3.5 理化指標測定

酸價的測定參照GB 5009.229—2016《食品中的酸價測定》[13]，過氧化值的測定參照GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》[14]。實驗均重復3 次。

1.4 數據處理

利用SPSS 22.0對指標進行差異性分析，采用Origin 2018繪制折線圖。代謝數據進行完整性檢查，剔除極值，總峰面積歸一化，以確保各樣本間和代謝物間可平行性比較。導入SIMCA-P 16.2軟件，進行無監督的主成分分析（principal component analysis，PCA）、OPLS-DA，觀察各樣本間是否可靠、穩定。隨后根據OPLS-DA結果篩選組間差異代謝物，結合T檢驗篩選組間顯著性差異代謝物。通過http://www.genome.jp/kegg/pathway.html查找京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路。利用R語言繪制聚類熱圖，采用Excel 2010繪制通路占比圖。

2 結果與分析

2.1 冷藏過程中原料乳酸價與過氧化值的變化

由圖1可知，冷藏0～6 d原料乳氧化過程持續進行，表現為酸價、過氧化值不斷升高。酸價可以代表原料乳中游離脂肪酸的總量[15]。由圖1A可知，隨冷藏時間的延長，原料乳酸價不斷上升（0.95～1.90 mg/g），不同階段其上升速度均有所差異，其中冷藏0～1 d酸價上升明顯（0.95～1.33 mg/g），隨后上升速度降低。

圖1 冷藏過程中原料乳脂肪氧化變化Fig. 1 Evolution of lipid oxidation in raw milk during cold storage

過氧化物為脂肪氧化的初級氧化產物，其分解會產生難聞氣味的低分子質量有害物質如醛、酮、醇等氧化物及氫過氧化物[16]，故其值可判斷脂肪氧化程度[15]。由圖1B發現，原料乳過氧化值整體偏低（0.007 2～0.040 6 mg/100 g）。其中冷藏0～1 d過氧化值的增加在整個冷藏階段最為明顯，其變化趨勢與酸價相似，隨后過氧化值隨冷藏時間延長緩慢增加。

2.2 基于UPLC-Q-TOF-MS對冷藏過程中原料乳的多元變量分析

2.2.1 樣本QC分析

如圖2所示，各色譜峰的響應強度和保留時間基本重疊，表明在整個實驗過程中儀器誤差引起的變異較小，信號較為穩定。將所有實驗樣本和QC樣本提取得到的峰，經Pareto-scaling處理后進行PCA，其得分圖見圖3。所有QC樣本在PCA空間緊密聚集，各實驗樣本之間分離效果較好，說明代謝物數據結果可靠。

圖2 QC樣品正負離子模式總離子流重疊圖譜Fig. 2 Overlapped total ion current chromatograms of QC samples in positive and negative ion modes

圖3 QC組和實驗組樣本質控PCA得分圖Fig. 3 PCA score plot of QC group and experimental sample quality control

2.2.2 OPLS-DA結果

為比較不同冷藏時間對比組間代謝物差異，采用多變量分析法分割有效區域，并進行OPLS-DA。如圖4所示，4 組模型的R2、Q2值相對較高，且置換檢驗圖回歸線在Y軸上截距小于0，Q2的斜率均大于R2，表明該模型的穩健性可靠。在OPLS-DA得分圖中分析得出各個組間分散，組內相互聚集，即不同冷藏時間對比組存在顯著代謝差異。

圖4 負離子模式下OPLS-DA得分圖及置換檢驗圖Fig. 4 OPLS-DA score plots for differential metabolites identified in negative ion mode and permutation test plots

2.3 冷藏過程中原料乳顯著性差異代謝物篩選

變量投影重要性（variable importance projection，VIP）可反映變量對樣本分類判別的影響和解釋能力，當VIP值大于1時，變量對組間分離有顯著貢獻。本實驗以VIP值大于1為條件，根據OPLS-DA模型的VIP值從原料乳的正離子（9 483 個）和負離子（8 682 個）代謝物中篩選潛在差異代謝物。結合T檢驗，將P值小于0.05的物質作為顯著性差異代謝物。由表1可知，整個冷藏過程中顯著性差異代謝物數量呈先增（0～3 d）后減（4 d）再增（6 d）的趨勢。各類代謝物變化較為復雜，無明顯規律。其中上調代謝物數量在冷藏0～3 d無較大變化，冷藏4 d時數量明顯增加，后隨時間的延長數量下降。下調代謝物數量波動趨勢與顯著性差異代謝物數量變化一致。

表1 顯著性差異代謝物的篩選結果Table 1 Results of screening for significantly differential metabolites

1 d與0 d相比，存在20 種顯著性差異代謝物 （表1），多為上調代謝物，且以脂類為主。3 d與1 d相比，篩選出44 種顯著性差異代謝物，上調數明顯低于下調數，其中氨基酸、碳水化合物、脂類及有機酸數量存在不同程度的增長。4 d與3 d相比，顯著性差異代謝物降至36 種，上調數高于下調數，氨基酸、維生素基本上調，脂類下調。6 d與4 d相比，顯著性差異代謝物有40 種，其中13 個代謝物上調，27 個代謝物下調，除脂類外，其余代謝物數量變化不大。在整個冷藏過程中脂類代謝物表現出高活躍性，相較于各類代謝物其數量始終占比最大，變化過程較為復雜。在冷藏3～4 d時脂類數量急劇下降，而冷藏6 d又恢復原有數量，可見脂類在冷藏中期會發生劇烈變化，這可能是由于原料乳本身成分復雜，脂肪氧化各階段變化不一所導致。

2.4 冷藏過程中原料乳脂類代謝物聚類、種類變化及其通路分析

代謝組學結果顯示冷藏過程中脂類物質在乳體系最為活躍（表1）。脂肪是乳的重要成分，相較于其他組分占比大（3%～5%）、消化率高（95%）[17]。乳脂類物質在冷藏過程極易被氧化分解，產生大量的自由基及過氧化物，同時在脂肪酸降解途徑中會產生有害醛酮等物質，從而造成乳品風味、色澤、質地等發生改變，最終導致乳品質變質[18]。因此，探究原料乳脂類代謝物在冷藏過程中的變化情況尤為重要。

將冷藏各階段原料乳顯著性脂類差異代謝物進行可視化聚類分析，具體劃分為I、II兩個區域。結果見圖5。I區中大部分代謝物在冷藏期內變化復雜，無明顯規律，包括月桂酸、3-羥基十二酸、檸蘋酸、1-棕櫚酸-2-油酰磷酸甘油及二十碳五烯酸等。其中，代謝物2-乙基-2-羥基丁酸、2-甲基-3-羥基丁酸僅在冷藏6 d富集。II區顯著性差異代謝物數量居多，占總量的60.5%，在冷藏0～1 d顯著富集（26 種）。單亞油酸甘油酯、肉豆蔻油酸及亞油酸等代謝物在冷藏0～1 d含量最高，并隨冷藏時間的延長逐漸減少。二軟脂酸磷脂酰膽堿、N-棕櫚酰神經鞘氨醇及鞘磷脂在冷藏3～6 d呈現大幅下降趨勢。由于乳脂代謝物的種類復雜、變化多樣，本研究將其分為甘油脂、游離脂肪酸及磷脂（表2）三大類進一步分析。結合脂類差異代謝物平均表達量的變化在KEGG數據庫中尋找相關代謝通路。結果顯示脂類顯著性差異代謝物參與的代謝通路種類較多。歸類后共整理出9 條涉及脂類代謝的通路（圖6，KEGG第三層級）。結合代謝通路對甘油脂、游離脂肪酸及磷脂三類代謝物變化進一步分析。

圖5 冷藏過程中原料乳顯著性差異脂類代謝物的聚類熱圖Fig. 5 Clustering heat map of significantly differential lipid metabolites in raw milk during refrigerated period

圖6 顯著性脂類差異代謝物在脂代謝通路中的占比Fig. 6 Percentage of significantly differential lipid metabolites in metabolic pathway

表2 冷藏階段脂類代謝物表達量Table 2 Expression patterns of significantly differential lipid metabolites during refrigerated storage

2.4.1 甘油酯的變化

乳腺上皮細胞分泌的乳脂由甘油酯組成，以乳脂球（milk fat globule，MFG）的形式存在，被乳脂球膜（milk fat globule membrane，MFGM）的復雜三層膜包圍[19]。由表2可知，參與脂類代謝的甘油酯代謝物整體上較少，共6 種。包括1-棕櫚酰-2-油酰磷酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、1-硬脂酰-2-花生酰-sn-甘油酯、單棕櫚酸甘油酯、單亞油酸甘油酯及肉豆蔻酸單甘油酯。其中， 1-棕櫚酰-2-油酰磷酸甘油酯表達量在冷藏0～3 d上調，而冷藏4 d開始下調，至冷藏6 d表達量變化不大；硬脂酸甘油酯在冷藏3～4 d呈現與前者相反的變化趨勢，而冷藏6 d表達量又轉為下調。冷藏整個階段，1-硬脂酰-2-花生酰-sn-甘油、單棕櫚酸甘油酯、單亞油酸甘油酯及單肉豆蔻酸甘油酯表達量均呈不斷下調趨勢。

2.4.2 游離脂肪酸的變化

乳脂中含有大量的游離脂肪酸（表2）。含量排前3位的游離脂肪酸依次為棕櫚酸（C16:0）、油酸（C18:1）、肉豆蔻酸（C14:0）。該結果與Liu Zhiqian[20]、李磊[21]等所得結論基本一致。實驗結果顯示飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸占比分別約為50%、17%、33%。檢測到的飽和脂肪酸為月桂酸、正癸酸、棕櫚酸、16-羥基棕櫚酸、肉豆蔻酸、十七烷酸、3-羥基-十二烷酸、2-甲基-3-羥基丁酸及2-乙基-2-羥基丁酸；單不飽和脂肪酸為肉豆蔻油酸、棕櫚油酸及油酸；多不飽和脂肪酸為順-6,9,12,15-十八碳四烯酸、二十碳五烯酸、亞油酸、(±)-蘇式-9,10-二羥基-12(Z)-十八碳烯酸、全順式(6,9,12)-亞麻酸及2E-二十碳烯酸。參與脂質代謝的游離脂肪酸表達量變化在各時間點均有所區別。冷藏階段，有7 種游離脂肪酸表達量下調，即飽和脂肪酸棕櫚酸、16-羥基棕櫚酸及十七烷酸，單不飽和脂肪酸油酸，多不飽和脂肪酸亞油酸、(±)-蘇式-9,10-二羥基-12(Z)-十八碳烯酸及2E-二十碳烯酸；5 種表達量上調，即飽和脂肪酸肉豆蔻酸、3-羥基十二烷酸、2-甲基-3-羥基丁酸及2-乙基-2-羥基丁酸，多不飽和脂肪酸二十碳五烯酸。6 種游離脂肪酸在冷藏階段呈現較強的波動性，無明顯規律，即月桂酸、正癸酸、肉豆蔻油酸、棕櫚油酸、順-6,9,12,15-十八碳四烯酸及全順式(6,9,12)-亞麻酸。整個冷藏過程中，各類游離脂肪酸變化過程多集中在冷藏3～4 d，且多數呈下調?？梢娎洳?～4 d這一階段是原料乳各類游離脂肪酸代謝物變化的關鍵時間點。

冷藏3 d時脂類代謝通路數量達到高峰（圖6），其原因是該階段各類游離脂肪酸數量及表達量的明顯變化所導致。其中脂肪酸生物合成、不飽和脂肪酸生物合成、亞油酸代謝通路均表達極顯著（P＜0.01），參與其通路的最活躍代謝物為棕櫚酸。冷藏4 d時棕櫚酸表達量無明顯變化，從而導致脂類代謝通路數量整體減少。

2.4.3 磷脂的變化

磷脂約占原料乳脂的1%，其作為MFGM的主要組成成分維持著乳脂的物理穩定性[22]。一般將磷脂分為甘油磷脂（glycerophospholipid，GP）和鞘脂（sphingolipid，SP）兩大類[23-25]。由表2可知，GP有磷脂酰膽堿（glycerophosphatidylcholine，PC）及磷脂酰乙醇胺（glycerophosphatidylethanolamine，PE）2 種亞類，PC包含1-十六酰-sn-丙三醇-磷酸膽堿、1,2-二油酰基卵磷脂、2-oleoyl-1-stearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine、 1-軟脂基硫基-2-軟脂?；被?1,2-二脫氧基-sn-甘油-3-膽堿磷酸、二軟脂酸磷脂酰膽堿、磷酰膽堿及1-十四酰-2-羥基卵磷脂8 種顯著性差異代謝物。PE含有1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1-棕櫚-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺2 種顯著性差異代謝物。SP有神經酰胺和鞘磷脂2 種亞類。神經酰胺含有N-棕櫚酰神經鞘氨醇1 種代謝物。鞘磷脂含有鞘磷脂（d18:1/18:0）1 種代謝物。整個冷藏階段，4 種GP代謝物表達量變化并無明顯規律，1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine表達量上調，其余磷脂代謝物 （7 種）均呈現下調。整體觀察發現，近一半的磷脂代謝物在冷藏0～4 d表達量無明顯變化，而冷藏6 d開始大幅下調，其原因有待后續進一步探究。

冷藏3～6 d均具有與磷脂相關的代謝通路（圖6），且冷藏3～4 d二軟脂酸磷脂酰膽堿表現活躍，參與多種脂質代謝，如亞油酸代謝、不飽和脂肪酸代謝、甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝及α-亞麻酸代謝。冷藏6 d鞘磷脂（d18:1/18:0）表達量顯著上調，使鞘脂類代謝較活躍。

3 討 論

通常，原料乳擠出后會立即冷卻并進行4 ℃冷藏。即便如此，低溫仍會損壞原料乳的結構，無法完全避免脂肪氧化、酶促反應及微生物降解等反應。通過分泌上皮細胞、乳腺自身合成等途徑產生的內源酶及貯存過程中嗜冷微生物產生的外源酶等在低溫下仍會分解、代謝原料乳中的營養物質，使原料乳成分改變，導致其最終腐敗。

冷藏過程中，乳體系代謝復雜，無明顯規律。顯著性差異代謝物結果顯示，整個代謝過程中脂類代謝占主導地位，該結論與Tribst等[2]研究結果一致。大量報道顯示，微生物特別是嗜冷微生物冷藏過程中的生長是導致乳及乳制品品質劣變的主要原因。假單胞菌、不動桿菌、黃桿菌及沙雷氏菌等[26-27]會產生穩定性較高的蛋白酶，其作用于MFG的保護膜，導致MFGM破裂，從而釋放出膜內包裹的脂肪。嗜冷微生物產生的脂肪酶及內源性酯酶會共同分解MFG中釋放的脂類物質，隨時間變化的脂類代謝物不斷改變，最終造成原料乳產生酸敗味、苦肽等異味，并導致乳中營養成分的劣變[28]。

聚類熱圖及脂類代謝物表達量分析顯示大部分脂類代謝物在冷藏0～1 d時表達量無明顯變化，而變化多集中在冷藏3～6 d，尤其是冷藏6 d。將脂肪氧化指標與各類脂類代謝物表達量變化結合分析，發現雖然二者冷藏階段均具有較大的轉變，但是脂肪氧化速度降低時（冷藏1～3 d）大部分逐漸積累的脂類代謝物表達量卻下調，可見乳脂氧化并不是影響脂類代謝物變化的關鍵因素，受復雜乳成分及乳環境的影響，乳脂肪氧化反應并不會同步推動脂類物質變化，乳中脂類代謝物的變化是脂肪氧化分解與脂質合成共同作用的結果。

在3 類顯著性脂類差異代謝物中，游離脂肪酸、磷脂變化尤為突出。其中大部分游離脂肪酸進入冷藏中期（3 d）表達量下調，且隨冷藏時間的延長含量逐漸減少。KEGG通路分析顯示，該階段新增游離脂肪酸表現活躍且主要參與了脂肪酸生物合成、不飽和脂肪酸生物合成及亞油酸代謝。這種現象可能與3 d后假單胞菌成為原料乳優勢菌屬相關[1]。研究表明，假單胞菌位于編碼lipA基因胞外脂肪酶的多順反子操縱子起始位置的 aprx基因[29-30]，其表達的脂肪酶可能作用于甘油三酯的α部位[31]，將乳中游離脂肪酸代謝水解為小分子物質。然而游離脂肪酸中2-乙基-2-羥基丁酸、2-甲基-3-羥基丁酸含量變化較為特殊，即冷藏4～6 d上調且含量隨冷藏時間延長成倍增加，其變化可能與脂肪酶選擇性地釋放丁酸有關[32]。關于磷脂變化，本研究發現SP及部分GP在原料乳冷藏6 d下調。KEGG通路分析顯示冷藏6 d時新增了一條與磷脂代謝相關的通路。前期在乳內源酶黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶及堿性磷酸酶的作用下MFGM被分解，此階段（冷藏6 d）作為MFGM的重要組成成分的磷脂類物質與乳體系中其他物質發生反應[33-34]，導致磷脂含量降低。同時此時的熒光假單胞菌所產生的磷脂酶C對磷脂的水解程度達到最大化[35-36]，且磷脂酶C與脂肪酶協同作用加快了磷脂的脂解速度[37]。

脂類代謝物的變化會使乳品質發生轉變，而導致脂類代謝物轉變的各類因素同樣影響乳組織及風味。冷藏3 d假單胞菌與脂肪酶作用使乳黏度逐漸增強，蛋白酶溶解乳中部分酪蛋白，導致膠束穩定性破壞、苦肽形成及氨基酸分解，最終乳組織出現乳清蛋白沉淀、凝塊等現象并產生苦味物質[38-39]。同時各類嗜冷菌生成的脂酶會共同攻擊乳中MFG，使球狀甘油三酯暴露，導致乳表面出現絮狀物。而磷脂酶的水解產物會產生類油氣味的烷烴、烷-2-烯醛和烷-2,4-二烯醛[40]。綜上，內源酶、嗜冷微生物及其酶類作用可能是冷藏3～6 d游離脂肪酸、磷脂表達量劇烈變化的主要因素，最終導致乳品風味、質地、組織趨于劣變狀態。因此冷藏3 d可作為原料乳冷藏品質控制的關鍵節點。