基于GC-MS指紋圖譜及化學模式識別分析河南不同產地香椿揮發性成分

趙麗麗，程菁菁，王趙改，史冠瑩，張 樂，王曉敏，蔣鵬飛，王旭增

（河南省農業科學院農副產品加工研究中心，河南 鄭州 450000）

香椿（Toona sinensis(A.Juss.) Roem）為楝科香椿屬落葉喬木[1]，是我國重要的特產木本風味植物資源之一，已有2 300多年的栽培歷史[2]。香椿營養價值豐富，具有顯著的抗氧化、抑菌、抗癌及降血糖活性[3-9]。此外，香椿因其濃郁的特征香氣而備受青睞，其所含有的獨特揮發性成分是區別于其他蔬菜的關鍵，直接決定其食用價值、商品價值及產業前景[10]。河南為香椿的主栽產地，種植面積大，目前已在鄭州、中牟、登封、許昌、焦作、安陽、駐馬店、桐柏等地形成千畝基地近20 個，已發展成我省“富民工程”的現代特色農業[11-12]。但受栽培地區土壤、氣候等多種因素影響，不同地區香椿特有風味存在差異，使其在深加工應用領域受到一定程度的限制[13-15]，故快速有效鑒定香椿揮發性成分并獲取其產地信息，客觀評價并控制其質量是亟需解決的問題。

氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）指紋圖譜是指樣品經適當處理后，采用GC-MS檢測得到的，能夠標示樣品中各組分共有峰的圖譜[16]。該圖譜能夠將食品中特有的揮發性成分通過特定信息化處理，對食品進行分析識別，具有整體性、全面性和唯一性，可用于產品產地溯源、真假識別及質量優劣判別，目前已被廣泛應用于茶葉、蜂蜜、葡萄酒及其他食品的氣味識別研究[17-18]。龍立梅等[19]采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）與GC-MS聯用技術，建立不同等級信陽毛尖茶GC-MS指紋圖譜，為綠茶的品質區分和分等定級提供了一種客觀量化的方法選擇；王華堂等[20]采用HS-SPME和GC-MS聯用法，分別建立蜂龍眼蜜和意蜂龍眼蜜揮發性成分GC-MS指紋圖譜，為蜂蜜的科學評價提供參考；王紅廣等[21]采用HS-SPME與GC-MS聯用技術，構建山西老陳醋香氣的GC-MS指紋圖譜，并借助聚類分析結合香氣風味特性分析實現了對山西老陳醋的身份識別。

化學模式識別技術是利用統計學、信號處理、數學算法等工具，從化學量測數據推理出物質類的本質屬性，進而對物質進行識別和歸類的一門技術[22]。其能夠較好地迎合指紋圖譜整體性和模糊性的要求，分為無監督模式識別方法和有監督模式識別方法2 類[23-24]。無監督模式識別是指在無樣品類別信息的情況下，進行學習或訓練，獲取分類信息的方法；有監督模式識別則是根據樣品特征和已知類別的樣品（訓練集），用特定的方法或模型進行學習或訓練，從而建立分類模型，再根據獲取的分類模型和未知樣品的特征，對未知樣品進行 分類[25]。其中無監督的模式識別方法包括聚類分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）等。有監督的模式識別方法包括簇類獨立軟模式法、判別分析、偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLSDA）、人工神經網絡等[25]。目前，化學模式識別技術已被應用于中藥及食品質量控制方面。青旺旺等[26]采用GC指紋圖譜結合化學模式識別，實現了20 批沉香化氣片的區分，并發現造成不同批次樣品差異的主要標記物，為科學評價與有效控制沉香化氣片的質量提供了可靠參考。蔡瑋琦等[27]采用高效液相色譜指紋圖譜結合化學模式識別技術，將紅糖、白砂糖、赤砂糖、黑糖進行有效區分，并找到了主要差異性成分。然而，目前國內外鮮見使用GC-MS指紋圖譜技術結合化學模式識別（PCA及CA）進行香椿產地溯源的研究。

本研究擬以河南省不同地域來源的香椿嫩芽為對象，采用HS-SPME-GC-MS技術，首次將“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”引入香椿復雜風味體系，構建香椿揮發性成分GC-MS指紋圖譜，并結合化學模式識別分析，以期探索和建立一種判別香椿地理源的方法，為香椿的快速溯源、品質控制和食品安全提供一定的理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

17 批次香椿樣品分別取自河南省8 個不同地區不同采收期，其中S1～S16 16 批次香椿樣品主要用于GC-MS指紋圖譜的構建及化學模式識別，S17樣品用于方法驗證，其具體產地和采集時間見表1；液氮購自鄭州博越商貿股份有限公司。

表1 香椿樣品的來源Table 1 Sources of T. sinensis samples tested in this study

1.2 儀器與設備

7890A-5975C GC-MS聯用儀、HS-SPME裝置（包括手持式手柄、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭、20 mL帶硅膠墊棕色頂 空瓶） 美國安捷倫公司；ME204E型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IKA A11液氮研磨機 艾卡（廣州）儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME條件

取新鮮香椿，添加適量液氮，使用液氮研磨機進行粉碎。準確稱取（1.00±0.003）g于20 mL帶有硅膠墊的棕色頂空瓶中，密封后于40 ℃水浴中平衡15 min，插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，萃取頭距離樣品約1 cm，萃取30 min后取出萃取頭，插入GC-MS進樣口解吸5 min，同時開始采集保留時間和色譜峰強度等相關數據。

1.3.2 GC-MS聯用條件

GC條件：HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初溫40 ℃，保持3 min， 以5 ℃/min速率升溫至150 ℃，保持2 min，以8 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持5 min；進樣口溫度250 ℃；載氣He，流速1.0 mL/min；不分流進樣。

MS條件：電子電離源；掃描方式為全掃描；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度250 ℃；溶劑延遲3 min；質量掃描范圍m/z40～800；檢索圖庫為NIST 08.LIB。

1.3.3 方法學考察

精密度實驗：取同一香椿供試樣品，按照1.3.2節條件，連續進樣3 次，計算各共有峰保留時間和峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

重復性實驗：取同一香椿樣品，平行準備3 份供試樣品，按照1.3.2節條件，計算各共有峰保留時間和峰面積的RSD。

穩定性實驗：取同一香椿供試樣品，按照1.3.2節條件，分別于第0、12、24小時進樣，計算各共有峰保留時間和峰面積的RSD。

1.4 數據處理

用標準圖譜進行檢索分析、定性；將相似度大于800的峰作為確認，用峰面積歸一法計算各組分的相對含量。8 個不同產地16 批香椿樣品的GC-MS分析結果，根據相對保留時間和峰面積選取共有峰，采用SPSS 19.0軟件進行CA和PCA。

2 結果與分析

2.1 方法學考察結果

精密度實驗結果表明，各共有峰保留時間的RSD均小于0.17%，峰面積的RSD均小于1.87%，表明儀器精密度良好。重復性實驗結果表明，各共有峰保留時間的RSD均小于0.24%，峰面積的RSD均小于5.11%，表明該方法重復性良好。穩定性結果表明，各共有峰保留時間的RSD均小于0.13%，峰面積的RSD均小于2.02%，表明供試品在24 h內穩定性良好。

2.2 香椿中揮發性成分的種類及相對含量

將從河南省8 個不同產地16 批次香椿嫩芽樣品中鑒別出的248 種揮發性成分進行分類匯總，發現香椿嫩芽樣品中的揮發性成分主要分屬于醇類、含硫類、萜烯類、萜烯類氧化物、醛類、烷烴類、酯類、酸類、酮類和其他類。其中含硫類的相對含量最高，達52.84%；萜烯類和醛類的相對含量次之，分別為20.91%和17.67%；其他類別揮發性物質的相對含量均小于3.5%（圖1）。

圖1 16 種香椿嫩芽中揮發性化合物的相對含量Fig. 1 Relative contents of volatile compounds in 16 samples of T. sinensis

2.3 指紋圖譜的構建及共有模式的建立

中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統是通過數據處理軟件對多個中藥樣品指紋圖譜進行峰匹配，提取共有峰后，利用相似度判定指紋圖譜間的相似程度[28]。劉江等[24]統計發現指紋圖譜的建立，以色譜方法居多，且高效液相色譜和GC被認為是制訂指紋圖譜標準的理想方法，GC更是在分析揮發性組分方面具有優勢。由于香椿具有類似于中藥的復雜體系，因此應用指紋圖譜技術可以有效表征香椿揮發性成分。

將河南不同產地16 批次香椿嫩芽樣品揮發性成分的保留時間和峰面積數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（中國藥典委員會2004A版）”進行圖譜分析，以樣品S1的色譜峰為參照峰，時間寬度設為0.10 s。為提高相似度結果的可靠性，將多個共有色譜峰的保留時間校正后進行自動匹配，生成對照指紋圖譜（R）和16 批次香椿嫩芽樣品揮發性成分的GC-MS標準指紋圖譜 （圖2），共確認出6 個共有峰，并通過NIST 08.LIB標準譜庫檢索，查閱相關文獻資料，鑒定出該6 個共有峰的化學組成（表2）。結果表明不同產地香椿嫩芽揮發性成分的GC-MS指紋圖譜共有峰的相對保留時間差別較小，RSD在0.01%～0.31%之間，說明16 批次香椿嫩芽樣品揮發性特征成分基本相同。但其共有峰的相對峰面積差別較大，RSD在33.71%～114.77%之間，表明16 批次香椿嫩芽揮發性物質的主要特征成分含量差別較大，其主要受產地、生長期等條件影響，該結果與王曉敏[15]、 楊慧[29]等的結果一致。

圖2 16 批香椿嫩芽樣品揮發性成分的GC-MS指紋圖譜和對照指紋圖譜Fig. 2 GC-MS fingerprints of volatile components from 16 batches of T. sinensis tender buds and reference fingerprints

表2 16 批香椿嫩芽樣品揮發性成分GC-MS指紋圖譜中 6 個共有峰鑒定結果Table 2 Identification of six peaks common to GC-MS fingerprints of volatile components from 16 batches of T. sinensis tender buds

2.4 相似度分析

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（中國藥典委員會2004A版）”，以樣品S1的色譜圖作為參照圖譜，進行相似度評價，結果見表3，參照圖譜與其余15 批香椿嫩芽樣品圖譜相似度為0.198～0.992。樣品S2、S3與樣品S1最為接近，相似度大于0.99；樣品S6、S12、S14與樣品S1比較接近，相似度大于0.9；樣品S5、S7、S11、S13與樣品S1相似度大于0.8；樣品S9、S10、S16與樣品S1差異最大，相似度分別為0.198、0.495、0.512。因此，可以說明同一產地、同一采收期的香椿揮發性成分最相似，不同生長環境（高山、平原）的差異最顯著。

表3 共有模式下香椿嫩芽樣品的相似度評價結果Table 3 Similarity in volatile components among 16 batches of T. sinensis tender buds

2.5 化學模式識別

2.5.1 CA

CA法是一種常用的指紋圖譜技術質量評價方法，對沒有樣本所屬類別信息的物質，以分類圖形式進行直觀的系統分析，適用于對大批量樣品進行快速分類或身份識別[23]。將16 批香椿嫩芽樣品6 個共有峰的峰面積作為變量，得到16×6階原始數據，導入SPSS 19.0軟件進行CA，采用組間連接法，以歐氏距離平方為分類依據，相似度越大，2 個樣品之間的距離越近[30]。

如圖3所示，當類間距為25時，可將河南省不同產地16 批次香椿嫩芽揮發性成分聚為2 類，其中樣品S1、S2、S3、S5、S6、S7、S11、S12、S13、S14聚為第1類，樣品S4、S8、S9、S10、S15、S16聚為第2類。對照表1發現，第1類樣品多為頭茬，且產地均為平原，因此很好地聚為1 類；第2類樣品多為二茬，且許昌、信陽2 個產地樣品均采自高山，因此聚為1 類。

圖3 香椿嫩芽樣品揮發性成分的CA樹狀圖Fig. 3 Cluster analysis dendrogram of volatile components from T. sinensis buds

當類間距為5時，根據第1類樣品之間的差異又可將其分為3 類，樣品S5、S7、S11、S12聚為1 類，均集中在河南東部地區；樣品S1、S3、S6、S13、S14為1 類，產地大多集中在河南西部地區；S2單獨聚為1 類。當類間距為8時，根據第2類樣品之間的差異可將其分為3 類，樣品S9、S10均采自高山地區，被聚為1 類；樣品S4、S8、S15，其中S4、S8均為平原栽種，采收期相同，被聚為1 類；樣品S16采自高山地區，單獨聚為1 類。以上分析結果表明，在河南范圍內，采收期及產地（地理位置、海拔高度等）對香椿嫩芽揮發性成分具有顯著影響。朱永清等[31]同樣采用HS-SPME-GC-MS方法研究了“巴山紅”香椿芽葉5 個不同發育時期揮發性物質的組成特征，結果表明在不同發育時期揮發性組分的種類及相對含量具有明顯差異；王曉敏等[15]亦采用HS-SPME-GC-MS方法發現河南4 個產地香椿揮發性風味物質呈現明顯地域差異性。因此，本研究所得結果與文獻結果一致，且與相似度評價結果一致。

2.5.2 PCA

PCA是一種能夠將多個變量通過線性變換選出較少個數重要變量的一種多元統計方法[32]。以河南不同產地16 批香椿嫩芽樣品6 個共有峰的峰面積為變量形成16×6階數據，將該數據導入SPSS 19.0軟件中，選擇分析-降維-因子分析，在描述中選擇系數、顯著性水平和行列式，在旋轉中選擇最大方差法，輸出載荷圖，使用正交旋轉法進行PCA，得到前3 個PC的特征值分別為2.196、1.630、1.050（均大于1），累計方差貢獻率達81.257%，超過80%，說明前3 個PC綜合了16 批香椿樣品揮發性成分的絕大部分原始變量信息，能代表樣品揮發性成分的主要特征（表4）。如圖4所示，以空間散點的距離分，樣品S1、S2、S3、S5、S6、S7、S11、S12、S13、S14的PC相較于其他樣品較為相近，聚為1 類；樣品S4、S8、S9、S10、S15、S16的PC較為相近聚為第2類，不同樣品的揮發性成分之間存在明顯差異，PCA可將河南不同產地香椿進行有效區分，該結果與相似度評價及CA結果一致。

表4 PC總方差解釋Table 4 Eigenvalues and contributions to total variance of PC

圖4 香椿嫩芽樣品揮發性成分的PCA得分圖Fig. 4 PCA score plot of volatile components in T. sinensis buds

PCA載荷反映了各變量對PC的貢獻大小和貢獻方向，其絕對值越大，表明該變量對PC的貢獻越大，正負反映方向[33]。如圖5所示。在PC1上，共有物質2-己烯醛具有較高的正載荷，2,4-二甲基噻吩有較高的負載荷，說明PC1反映2-己烯醛和2,4-二甲基噻吩提供得到的綜合信息。含硫類物質一般具有較低的感知閾值（能夠感覺到有氣味的最小濃度）和較強的氣味，呈現出類似于大蒜、韭菜、洋蔥等刺激性氣味[34]，2,4-二甲基噻吩可能是由雙(1-丙烯基)二硫化物在經過高溫加熱后首先轉化 為2-巰基-3,4-二甲基-2,3-二氫噻吩，再進一步加熱降解所得[35-36]。醛類也是構成香椿主要香氣特征的一大類 物質[34]。Yang Wenxi[37]和Zhai Xiaoting[38]等采用分子感官技術均發現雙(1-丙烯基)二硫化物、己醛、反-2-己烯醛等為構成新鮮香椿獨特氣味的主要貢獻化合物。在PC2上，共有物質乙酸法呢醇酯表現出較高的正載荷，說明PC2反映乙酸法呢醇酯提供得到的信息。同理，PC3反映2-甲基-3-亞甲基-環戊烷甲醛提供得到的信息，表現出較高的正載荷。由此可以說明，2-己烯醛、2,4-二甲基噻吩、乙酸法呢醇酯及2-甲基-3-亞甲基-環戊烷甲醛是造成河南省不同產地不同采收期香椿嫩芽樣品中揮發性成分差異顯著的主要物質。2-己烯醛、2-甲基-3-亞甲基-環戊烷甲醛賦予香椿青香和草香，2,4-二甲基噻吩賦予香椿硫磺及蒜臭類辛辣刺激性氣味，乙酸法呢醇酯賦予香椿花香，共同對香椿嫩芽的整體風味起重要貢獻作用[39]。

圖5 香椿嫩芽樣品揮發性成分的PCA載荷圖Fig. 5 PCA loading plot of volatile components in T. sinensis buds

通過累計方差貢獻率提取的3 個PC為綜合評價指標，計算得到河南省16 批香椿嫩芽樣品揮發性成分的PC得分及綜合得分見表5。由表5可知，S16、S15香椿樣品的揮發性成分綜合得分最高。由于香椿獨特揮發性成分是決定香椿品質的關鍵影響因素，從香椿風味的角度，可以說明信陽高山栽種的香椿嫩芽品質最優，這可能是由于信陽高山氣候、土壤因子以及植被等綜合天然生態條件較適合香椿生長的緣故。因此，在選擇加工原料來源時，可根據產品要求選擇適宜產地取材。

表5 標準化后PC綜合得分Table 5 Comprehensive scores of PC after standardization

2.6 方法驗證

基于本實驗建立的河南不同產地香椿揮發性成分GC-MS指紋圖譜及化學模式識別分析，將采集到的駐馬店三茬香椿樣品（編號S17）揮發性成分6 個共有物質的GC-MS色譜峰峰面積數據代入SPSS 19.0軟件進行CA。如圖6所示，樣品S17、S11、S12明顯聚為1 類，說明樣品S17與樣品S11、S12歸屬于同一產地，能夠快速確定樣品S17來源于河南駐馬店。因此本實驗建立的GC-MS指紋圖譜結合化學模式識別方法對于河南不同產地香椿樣品的快速溯源具有較強的指導意義和實用參考價值。

圖6 香椿嫩芽樣品揮發性成分的CA樹狀圖Fig. 6 Cluster analysis dendrogram of volatile components from T. sinensis buds

3 結 論

本實驗將“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”引入香椿復雜風味體系中，構建了河南省8 個不同產地16 批次香椿嫩芽揮發性成分的GC-MS指紋圖譜，共確定出6 個共有峰，并鑒定出其化學成分分別為2-己烯醛、2,4-二甲基噻吩、2-甲基-3-亞甲基-環戊烷甲醛、β-紫羅蘭酮、1-氧阿司匹林[2.5]辛烷.5-5-二甲基-4-(3-甲基-1,3-丁二烯)、乙酸法呢醇酯。

根據中藥指紋圖譜相似度評價結果結合共有成分CA、PCA結果，發現河南省內不同產地、采收期的香椿嫩芽揮發性成分存在較大的差異。不同產地和采收期對香椿嫩芽揮發性成分影響顯著，同一生長期采收的樣品被很好地聚為一類，東部和西部、高山和平原栽種的樣品也能被很好地區分開。此外，PCA找到了引起不同批次香椿嫩芽樣品間風味差異的主要成分為2-己烯醛、 2,4-二甲基噻吩、乙酸法呢醇酯及2-甲基-3-亞甲基-環戊烷甲醛，同時發現信陽高山種植的香椿揮發性成分綜合得分最高。最后通過CA對未知產地香椿進行歸類，能夠快速鑒定出其產地來源。以上結果表明GC-MS指紋圖譜結合化學模式識別能夠明確不同生長期、不同地域香椿品質的差異，找出對香椿風味具有貢獻的特征香氣成分，為香椿的快速溯源、品質監控和食品安全供應提供一定的理論基礎和技術支撐。