細菌治療腫瘤的發展現狀及趨勢

馮 靜，柯章敏，王 麗，張秀偉，張允雷*

（1. 南京醫科大學附屬江寧醫院呼吸與危重癥醫學科，南京 211100；2. 南京醫科大學生物醫學工程與信息學院，南京 211100）

現代醫學的快速發展依然無法攻克多數晚期腫瘤無法治愈的難題，這極大促進了“非常規”治療手段如病毒［1］、細菌［2］和瘧原蟲［3］等治療方法的發展。特別是Coley醫生在19世紀90年代發明的細菌混合物治療腫瘤的方法，因細菌簡單易于操作的特點，再次成為21世紀的研究熱點［4］。

目前研究最多的腫瘤靶向細菌包括減毒諾維氏菌（Clostridiumnovyi-NT）［5］、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）［6］、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）［7］、大腸桿菌Nissle 1917（E. coliNissle 1917）［8］等，常被用于腫瘤的治療。基于以上細菌構建的抗腫瘤工程菌可以單獨治療，聯合化療、放療和免疫治療等抑制或者殺死腫瘤細胞［9-11］。同時，多種細菌及其衍生物制備的腫瘤靶向制劑已經進入臨床試驗階段或者正在進行相關的臨床招募［12-13］。伴隨著生物組學技術的發展，以及基因修飾技術的進步和免疫治療的興起，細菌治療腫瘤出現了新的發展趨勢。本文對近期細菌治療腫瘤的最新研究進展進行了綜述，并對其發展趨勢、應用前景和存在的問題進行了相關討論。

1 細菌對腫瘤的靶向性

1.1 實體腫瘤微環境

實體腫瘤微環境是設計和運用細菌靶向治療腫瘤的基礎。實體腫瘤不同于機體的正常組織，其具有低氧、低營養、低pH值和高滲透性的特點。在實體瘤體積不斷增大的過程中，正常組織的局部血管不足以維持腫瘤細胞的生長，從而觸發腫瘤血管生成因子的釋放來形成新的血管網，失去正常的血管結構［14］。這種混亂、不穩定的新生血管網絡主要分布在腫瘤組織外圍，使得腫瘤內部氧氣和營養供應不足，腫瘤部位出現了暫時性或持久性的缺氧狀態，同時生成壞死組織［15］。為了應對缺氧，腫瘤細胞會通過糖酵解和無氧呼吸來供給能量，但會產生乳酸，使腫瘤部位的pH值低于正常組織［16］。而實體瘤致密的細胞外基質和較高的細胞密度，導致腫瘤內部形成了較高的滲透壓，從而阻止藥物分子向缺乏血管的實體瘤內部滲透［17］。由于實體腫瘤微環境的特殊性導致目前的臨床治療手段效果較差，因此，我們急需尋找新的高效的腫瘤治療手段。

1.2 細菌自身特性及對腫瘤的靶向能力

在自然界中，部分細菌能夠特異性地靶向實體瘤，克服實體腫瘤低氧、高滲透壓的微環境，進入腫瘤的壞死區生長繁殖。例如，減毒諾維氏菌和雙歧桿菌屬偏愛無氧環境，靜脈注射后會自動地聚集在腫瘤部位，而在正常組織中不能生存，這有效避免了細菌對正常組織細胞的損害［18-19］。正常情況下，藥物只能被動地隨著血液流動，導致到達腫瘤的藥物濃度隨著距離的增大而相應地減少。同時，由于腫瘤內部血管缺乏以及高滲透壓微環境使得藥物無法進入腫瘤內部［20］。而細菌作為生物體，在趨化因子和高滲透長滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR）的作用下靶向聚集到腫瘤中［20］，借助于其鞭毛運動進入實體瘤內部生長繁殖［21］。一些研究表明，鼠傷寒沙門氏菌不管是在體外還是體內，其遺傳物質經多代繁殖后依舊保持穩定，這為構建腫瘤靶向工程菌奠定了堅實的基礎［22］。通過DNA重組技術可以對腫瘤靶向細菌進行基因改造，產生腫瘤靶向性更高、毒性更小的細菌菌株，用于腫瘤的靶向治療。

事實上，兼性厭氧菌對腫瘤的靶向性低于專性厭氧菌，但是其更易于在體外進行修飾改造的便利性使其成為主要的研究對象。通過基因改造可以有效提升兼性厭氧菌的腫瘤靶向性。例如，將鼠傷寒沙門氏菌株生長所必需的基因asd置于低氧啟動子 PpepT之后，使得該菌株只能在低氧的腫瘤環境中生長繁殖，而當在有氧的正常組織中，有氧啟動子PsodA會促進asd基因的反義轉錄，使得其無法在正常組織中存活［23］（圖1）。更重要的是，細菌不僅可以進入實體瘤內部，還可以隨著腫瘤細胞進行轉移。鼠傷寒沙門氏菌經靜脈注射小鼠后，該細菌出現在腫瘤的每一個轉移灶中。其中，44.0%的細菌都分散在腫瘤轉移組織中，而只有0.5%的細菌存在于正常的肝組織［9］。另外，αvβ3整合素通常在活化的內皮細胞和部分腫瘤細胞膜上高表達，而精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）對其具有高度靶向性。通過DNA技術在鼠傷寒沙門氏菌細胞膜上表達RGD多肽，可以顯著增加其對腫瘤的靶向性［24］（圖1）。另外，在細菌表面表達癌胚抗原的特異性抗體（antibody），不僅能增加細菌的腫瘤靶向性，而且可以顯著增強基于細菌構建的癌癥疫苗的免疫原性［25-26］。而通過腫瘤靶向菌合成表達黏附素，可以顯著增加細菌對實體腫瘤的黏附性，從而提高細菌的腫瘤靶向性［27］。另外，針對腫瘤酸性微環境的特點，基因改造鼠傷寒沙門氏菌使STM1787啟動子在酸性腫瘤微環境中優先被激活，從而驅動治療性基因的表達，并借助于沙門氏菌特異性地定位于原發腫瘤和體內轉移灶的特點達到治療的目的［28］。除了利用腫瘤微環境低氧和低pH值的特點來改造細菌外，設計營養缺陷型細菌也是提高細菌靶向腫瘤性的常用方法。將鼠傷寒沙門氏菌A1菌株設計為亮氨酸/精氨酸營養缺陷型細菌，該菌在腫瘤中能獲得充足的營養而定殖于腫瘤部位，而其在正常組織中由于缺乏必需氨基酸不能正常生長［29］。脂多糖是導致細菌毒性反應的重要組分，敲除脂多糖基因的鼠傷寒沙門氏菌缺失突變體具有較好的腫瘤特異性和顯著降低的致病性［30］。

圖1 基因修飾和腫瘤靶向分子鑲嵌增加細菌的腫瘤靶向性Fig. 1 Increasing bacterial tumor-targeting ability using gene modification and molecular decoration

2 細菌利用納米材料及自身衍生物靶向成像和治療腫瘤

納米材料具有良好的腫瘤滲透性、EPR效應和較高的藥物裝載能力等特性，這使得納米材料在腫瘤治療方面具有重要的應用潛力［31］。納米材料具有較小的顆粒尺寸使其可以自由穿越毛細血管。EPR效應可以使納米材料較多地滯留在腫瘤部位，但是肝臟和脾臟會截留70%以上的納米顆粒［32］。為了增強納米顆粒的腫瘤靶向能力，可以在納米顆粒表面修飾腫瘤靶向分子，如腫瘤細胞表面受體的抗體、親合體、肽或者有機小分子物質等［33］。但是這些靶向分子的純化與制備成本較高，修飾組分不穩定，只有部分顆粒能夠到達腫瘤部位［34］。而利用細菌獨特的腫瘤靶向特性可以彌補納米材料在腫瘤治療中的不足。例如，研究者利用艱難梭狀芽孢桿菌（Clostridium difficile）的孢子來攜帶納米材料，通過納米材料的抗體將藥物和納米材料結合。艱難梭狀芽孢桿菌的孢子在有氧條件下無法生長繁殖，只有到達缺氧的腫瘤微環境中才能萌芽生長。這種以抗體為導向的策略顯示了較好的治療效果［35］。另外，通過電穿孔的方法將納米材料導入到細菌內，同時在細菌表面鑲嵌葉酸（folic acid），使其可與腫瘤細胞表面高表達的葉酸受體結合而達到靶向腫瘤的目的，從而將更多的藥物遞送到腫瘤細胞中［36］（圖1）。為了提高腫瘤治療的療效和特異性，將低沸點全氟己烯包裹在與雙歧桿菌結合的納米顆粒中，在外界施加高強度聚焦超聲，在液-氣相變后破壞細胞來消除腫瘤［10］。同時，利用陽離子聚合物包裹DNA形成陽離子納米球，依靠靜電相互作用吸附于鼠傷寒沙門氏菌表面，從而實現細菌靶向載運DNA疫苗免疫治療腫瘤的目的［11］。

另外，細菌在生長過程中會分泌外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMV），其通過細菌外膜突出而形成，攜帶有細菌的細胞質以及周質空間的物質。大部分囊泡外層包裹著脂多糖，這種小尺寸的微型細菌可以強烈地激活宿主的免疫反應［37］。有研究者將大腸桿菌W3110菌株中的msbB基因敲除，抑制脂多糖的合成，可以顯著降低細菌囊泡的毒性［38］。將DNA藥物結合在納米顆粒上，利用細菌囊泡將其攜帶進入腫瘤部位，經腫瘤細胞吞噬后，DNA藥物被釋放并可以在細胞中表達［39］。通過電穿孔技術將紡錘體驅動蛋白的siRNA 導入到表達了 HER2（human epidermal growth factor receptor 2）affibody OMV 中，其可以有效降低腫瘤細胞中紡錘體驅動蛋白的表達，阻滯細胞周期并誘導細胞凋亡［40］。過繼轉移和基因敲除研究證實，大腸桿菌產生的OMV的免疫保護作用主要是通過刺激T細胞免疫，誘導Th1和Th17細胞反應，從而有效降低細菌感染誘發的致死率［41］。敲除細菌的細胞周期調控基因minCD，導致細胞非正常分裂而產生更多的細菌囊泡。同時，將酸性微環境靶向多肽展示在細菌的表面，可以使細菌靶向腫瘤酸性微環境，提高微細胞對腫瘤的靶向性［8］。

另外，細菌納米級衍生物質，如趨磁細菌產生的納米磁小體，因具有獨特的超順磁性、高分散性和良好的生物相容性等特點，近年來被廣泛用于腫瘤的成像和治療［42］。通過基因重組共表達抗HER2 affibody膜錨定蛋白 MamC，利用MamC和磷脂雙分子層的相互作用將affibody鑲嵌到納米磁小體的膜表面制備HER2靶向的納米磁小體。這種工程化納米磁小體可以通過與腫瘤細胞表面過表達的HER2相結合，實現納米磁小體在腫瘤部位的靶向聚集和磁共振T2成像［43］。如果將納米磁小體注射到荷神經膠質瘤的小鼠顱內，在交變磁場的作用下，納米磁小體會產生熱量殺死腫瘤細胞， 40% 的小鼠腫瘤會完全消退［44］。同時，基于趨磁細菌自身磁導向性而進行的磁引導下的腫瘤靶向治療已經興起。如Magnetococcus marinusMC-1趨磁細菌中每一個細胞都含有一個磁性氧化鐵納米晶體鏈，會沿著局部磁場線移動，基于兩態氣動傳感系統向低氧方向游動，可以在腫瘤中分布均勻，利用其載運含藥物納米脂質體，可以顯著提高藥物在腫瘤缺氧區域的濃度［45］。

3 細菌聯合化療、放療和免疫治療治療腫瘤

3.1 細菌載運化療藥物靶向治療腫瘤

化療是轉移性癌癥最重要的治療手段，因為藥物可以隨著血液流動到達全身的各個轉移灶，從而進行全身治療［46］。但是，由于實體瘤內部較高的間質性內壓以及較少的血管分布，使藥物無法進入腫瘤內部［47］。同時，化療藥物不僅會殺死腫瘤細胞，還會影響到毛囊、骨髓和胃腸道等正常細胞的生理功能，誘發機體嚴重的毒副作用［48］。而增加化療藥物的腫瘤靶向性，可以有效降低其對正常組織細胞的損傷。多個研究證明，細菌可以載運化療藥物，實現對腫瘤的靶向治療，減少藥物對機體的毒副作用。例如，脂質體（lipidosome）包裹紫杉醇（paclitaxel）藥物，依靠鏈霉親和素（streptomycin）與細菌外膜的生物素（biotin）結合，可以促進紫杉醇在腫瘤部位更多地聚集［49］（圖2）。此外，設計溫度敏感型的脂質體來包裹多柔比星藥物，利用生物素-鏈霉親和素將脂質體結合在鼠傷寒沙門氏菌的細胞膜上，通過鼠傷寒沙門氏菌的腫瘤靶向性將化療藥物更多地遞送到腫瘤中，再借助于高強度聚焦超聲進行加熱誘導藥物的釋放，可以有效地抑制腫瘤的生長［50］。而在小鼠黑色素瘤模型中，相比單獨使用環磷酰胺藥物，鼠傷寒沙門氏菌VNP20009與環磷酰胺聯合治療可以顯著降低腫瘤微血管密度和血管內皮生長因子的含量［51］。所以，相比于單獨的化療，細菌輔助化療不僅可以增強腫瘤的治療效果，而且可以降低化療的毒副作用。

3.2 細菌聯合放療治療腫瘤

放療主要是誘導腫瘤細胞的DNA發生損傷而殺死腫瘤細胞，而實體瘤內低氧微環境會顯著降低放療療效［52］。另外，有研究表明，放療會引起腫瘤細胞發生保護性自噬，從而維持內環境的穩定性，使腫瘤繼續增殖轉移［53］。將放射性同位素188Re通過抗體與李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）結合，將其注射到荷有高度轉移胰腺癌的小鼠體內，同位素僅在腫瘤原發部位少量存在，而在轉移灶中大量存在［54］（圖2）。通過饑餓反應，將32P滲入到李斯特氏菌中并注射到荷瘤小鼠體內，李斯特氏菌32P可以在腫瘤部位通過誘導的電離輻射和菌誘導的活性氧協同殺死腫瘤細胞［55］。

圖2 細菌聯合其它手段治療腫瘤Fig. 2 Bacteria combined with other methods to treat tumor

3.3 細菌聯合免疫治療殺死腫瘤細胞

免疫治療作為新型的臨床治療方法已經逐漸成為癌癥治療的重要手段。有研究表明，接受免疫治療后很多患者發生了3級或4級的不良事件，包括肝臟、胃腸道和腎臟疾病，還會使機體產生免疫耐受［56］。癌細胞可以通過分泌免疫抑制細胞因子，募集免疫抑制細胞和呈遞免疫檢查點蛋白等途徑來逃避機體的免疫系統［57］。事實上，微生物對機體的免疫系統有著廣泛的影響，它們不僅可以調節中樞神經系統組織駐留免疫細胞的成熟與功能，還影響外周免疫細胞的活化［58］。利用細菌表達鞭毛蛋白與腫瘤抗原協同呈遞給T細胞達到最優抗原呈遞效果，促進CD4+和CD8+T細胞的活化，激發機體產生適應性免疫反應來抑制腫瘤生長［59］（圖2）。利用基因修飾技術使大腸桿菌編碼表達CD47等納米抗體拮抗劑，增加腫瘤浸潤性T細胞的活化，可使腫瘤快速消退，并有效抑制腫瘤細胞的轉移［60］。

4 總結與展望

腫瘤靶向性細菌能夠特異性進入原位癌和全身的轉移灶，并且能夠在壞死區生長繁殖［61］。這種獨特的生長繁殖方式可以有效克服現有臨床腫瘤治療手段的缺陷，包括化療、分子靶向治療、細胞治療和抗體治療等藥物無法進入腫瘤內部，以及放療、手術治療和其他物理治療方法無法定位潛在的癌癥轉移灶等。然而，已經完成的部分臨床試驗結果表明，單獨使用細菌治療腫瘤并沒有取得顯著的抗腫瘤效果［62-63］。這主要是因為腫瘤靶向工程菌的細胞毒性無法完全殺傷腫瘤細胞，其分泌表達的藥物無法擴散到實體瘤的全部腫瘤細胞。另外，部分細菌的生長繁殖可能會促進腫瘤的生長和轉移，這也成為了臨床應用的一大重要障礙［64］。因此，細菌靶向治療與現有臨床治療手段的優勢交叉互補是其最終走向臨床的唯一途徑。另外，微生物組學的快速發展深刻揭示了細菌與腫瘤微環境免疫互作的關系［65］。多數被改造為免疫刺激因子的細菌單獨或者聯合放化療等對腫瘤進行綜合治療，取得了顯著的治療效果。同時，納米技術的發展為細菌靶向治療提供了新的輔助材料，其不僅增強了細菌的腫瘤靶向性，也可以顯著增強其抗腫瘤作用。

近年來，腫瘤免疫學全面揭示了腫瘤發生發展與機體免疫系統之間的復雜關系，也表明了癌癥治療是一個系統性工程［66］。非特異性免疫作為特異性免疫的重要補充在腫瘤的治療中具有巨大的應用前景。而細菌是非特異性免疫的重要免疫原，細菌來源的 Flagellin B［67］和 CpG DNA［68］都已經進入了非特異性免疫治療腫瘤的臨床試驗階段，這為細菌免疫治療腫瘤奠定了重要的理論基礎。因此，在細菌聯合放化療等常規治療手段的基礎上，多菌株結合病毒聯合治療以及利用腫瘤組織中被免疫細胞識別的細菌多肽免疫治療腫瘤將成為未來的研究發展方向。同時，細菌對腫瘤的靶向性，細菌與腫瘤微環境的相互作用以及細菌與免疫細胞的動態互作還需要更深入的研究，這將為推動細菌治療腫瘤提供堅實的理論基礎和新的發展方向。