擬康寧木霉對甲基橙廢水的酶促降解研究

王海琪，林 斌，潘碩濱，林錦美?

（集美大學 a. 海洋食品與生物工程學院；b. 港口與環境工程學院，廈門 361021）

甲基橙（methyl orange）因具有顯色劑性質且含有偶氮基而可作為偶氮染料。偶氮染料是現在染料市場中品種數量上最多的一種染料，因其合成簡單、成本低廉、染色性能突出等優點，被廣泛應用于紡織業、造紙廠工業生產中多種天然和合成纖維的染色和印花。偶氮染料通常含有復雜的芳香環結構，具有化學穩定性高、生物可降解性低等特點。多數染料及其代謝中間產物具有突變性、致癌性和其他毒性［1-3］。目前，投放市場的染料全世界多達30 000多種，每年排放到環境中的染料就高達600 000多噸［1-2］。甲基橙作為染料廢水中較難降解的一種偶氮類化合物［3］，需要一種經濟高效的染料廢水處理技術為其解決工業污染問題提供有力支持。相比于物理法和化學法，生物法具有吸附容量大、選擇性強、效率高、消耗少、費用低等優點［4-5］。基于此，本研究選取擬康寧木霉菌種（Trichoderma koningii），通過馴化，先考察氮源、碳源、pH等因素對該菌種生長情況和甲基橙脫色率的影響；然后在該菌種生長的最佳培養條件下提取胞內酶后，通過研究初始甲基橙濃度、pH、反應溫度、酶液投加量對甲基橙酶促降解的單因素和正交試驗，得出擬康寧木霉胞內酶去除甲基橙廢水的最優條件，初步揭示了擬康寧木霉降解甲基橙廢水的較優酶促降解條件和機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與培養基

本研究所用擬康寧木霉菌種由本實驗室提供，所用培養基為培養真菌常用的土豆培養基（土豆200.0 g/L，葡萄糖25.4 g/L，瓊脂25.4 g/L，磷酸二氫鉀2.1 g/L，硫酸鎂 2.1 g/L）［4］。將擬康寧木霉菌種接種在滅菌后的培養基上，在24℃生化培養箱中培養4 d。

梯度馴化：在已接種的固體培養基中依次加入一系列不同質量濃度的甲基橙放入培養皿中，在24℃培養箱中進行菌種的培養馴化。將每一批從質量濃度最高的培養基中選出馴化好的菌種接種入下一批更大質量濃度的培養基中，將最終的優勢菌種接種于甲基橙質量濃度為100 mg/L的固體培養基中保藏備用［7］。

1.1.2 模擬廢水

甲基橙模擬廢水的配制：稱取1 g的甲基橙于1 L的燒杯中，用超純水溶解后倒入1 L容量瓶中定容，配制成1 000 mg/L的樣品溶液備用。

1.1.3 儀器與試劑

主要儀器：可見分光光度計（WFJ7200）、超聲波細胞粉碎機（YXQ-LS-30SI）、智能生化培養箱（PHX）、恒溫振蕩器（SHA-C）、高速冷凍離心機（Avanti J-26XP）。

主要試劑：葡萄糖（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）、硫酸鎂（分析純）、瓊脂粉、氫氧化鈉（分析純）、硝酸（分析純）、甲基橙、磷酸二氫鈉（分析純）、十二水合磷酸氫二鈉（分析純）。

1.2 試驗方法

1.2.1 甲基橙標準曲線的繪制

分光光度法測定色度：取質量濃度為50 mg/L的甲基橙溶液于紫外-可見分光光度計上，在250～600 nm范圍內進行掃描，甲基橙的最大吸收波長為463 nm。

取上述配制的甲基橙溶液分別制成0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mg/L的甲基橙溶液，待溶液充分混勻后測定吸光度。繪制標準曲線見圖1。

圖1 甲基橙的標準曲線Fig. 1 The standard curve of methyl orange

在甲基橙的最大吸收波長463 nm下測定每批處理前、后溶液的吸光度值A0、A。

標準曲線的計算公式如下：

式（1）中，A為吸附染料后溶液的吸光度，A0為吸附染料前溶液的吸光度。

1.2.2 模擬廢水樣的預處理及測定

將震蕩后的水樣通過0.45 μm濾膜過濾，水樣的吸光度測定步驟同1.2.1所述。

1.2.3 擬康寧木霉酶的提取［8］

胞內酶提取：菌株8 000 r/min離心15 min，收集菌體。將收集到的菌體用pH 7.0的0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（Na2HPO4-NaH2PO4）洗滌3次，離心收集菌體。以1.0 g 濕菌體添加3 mL磷酸鹽緩沖液的比例，將菌體懸浮于緩沖溶液中，置于冰浴中用超聲波細胞粉碎機的中粗探頭處理10 次，每次1 min，功率為300 W，破碎時間為5 s，間隔5 s。最后離心除去細胞碎片，得到胞內酶液。

1.2.4 擬康寧木霉生長前期處理甲基橙廢水可行性試驗

菌種培養條件的探索：在含有甲基橙的液體培養基150 mL中接種馴化完畢的擬康寧木霉菌，在30℃、140 r/min的恒溫振蕩器內培養，培養過程中測定吸光度并計算脫色率［9-10］。

1.2.5 擬康寧木霉酶處理甲基橙廢水單因素試驗

分別從甲基橙濃度、pH、溫度、酶投加量4個因素探討對擬康寧木霉酶促降解的影響［11-12］。

1.2.6 擬康寧木霉酶促降解正交試驗

為了尋求最佳配比關系，本次正交試驗采用L9（33）的標準表，即三因素、三水平，共需完成9次試驗。9組試驗分別于最佳甲基橙質量濃度的條件下反應4 h后，測其吸光度并計算脫色率［13-14］。

1.2.7 擬康寧木霉菌酶促降解最適試驗

在正交試驗的基礎上，選取最佳的酶液投加量、水浴溫度、pH、甲基橙初始質量濃度進行反應，每隔一段時間檢測吸光度并計算去除率，觀察染料處理情況。

2 結果與分析

2.1 氮源（甲基橙）對擬康寧木霉培養過程脫色與生長量的影響

培養基中甲基橙質量濃度分別為10、30、50、70、100、150 mg/L，接種后培養72 h，取出測定吸光度與菌種重量，并計算甲基橙脫色率。由圖2可知：當甲基橙初始質量濃度為10～30 mg/L時，擬康寧木霉菌對甲基橙廢水的脫色效果逐漸增加；30 mg/L時甲基橙脫色率達到最大，脫色率可達74.53%，同時菌重也達到最大；30 mg/L后脫色效果逐漸下降。

圖2 氮源對擬康寧木霉生長前期脫色率與生長量的影響Fig. 2 Effects of nitrogen source on decolorization rate and growth amount of Trichoderma koningii in early growth period

擬康寧木霉在低質量濃度甲基橙的情況下，可以將甲基橙作為自身氮源轉化利用，對甲基橙的脫色效果較佳；但過高質量濃度的甲基橙對細菌的生長存在較大的阻礙作用，當甲基橙的質量濃度達到100 mg/L以后，菌量的減少量放緩，擬康寧木霉生長受到限制。故取甲基橙質量濃度為30 mg/L作為較佳的氮源。

2.2 碳源(葡萄糖)對擬康寧木霉培養過程脫色與生長量的影響

制備含甲基橙質量濃度為30 mg/L的培養基6份，分別加入葡萄糖使其質量濃度為10、15、20、25、30、40 g/L，同2.1處理后計算脫色率。由圖3可知，脫色率隨葡萄糖質量濃度的增大呈S型，當質量濃度增大至25 g/L后趨于穩定，菌體干重隨著葡萄糖質量濃度的增大而上升。據推測，隨著培養基中葡萄糖的質量濃度增加引起擬康寧木霉酶的碳氮比變化，酶的產生受到抑制，導致脫色率降低。故設定葡萄糖質量濃度為25 g/L作為最佳碳源濃度［15］。

圖3 碳源對擬康寧木霉生長前期脫色及生長量的影響Fig. 3 Effects of carbon sources on decolorization and growth of Trichoderma koningii in early growth period

2.3 pH對擬康寧木霉培養過程脫色與生長量的影響［16］

分別配制pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5含甲基橙濃度為30 mg/L的培養基7份，接種馴化后的擬康寧木霉，同2.1處理并計算甲基橙脫色率。由圖4可知：隨著pH增加，染料脫色效果顯著提高，菌量也逐漸增加；當pH為6.5時，脫色率達到最大，菌量趨于平緩；當pH大于6.5時，甲基橙脫色率逐漸下降，到pH為8.5時達到最低，菌量也隨之下降。故選取擬康寧木霉生長pH為6.0～6.5。

圖4 pH對擬康寧木霉生長前期脫色率與生長量的影響Fig. 4 The influence of pH on decolorization rate and growth amount of Trichoderma koningii in early growth period

2.4 甲基橙質量濃度對擬康寧木霉酶促降解效果的影響

配制甲基橙質量濃度分別為20、40、60、80、100、120 mg/L的磷酸鹽緩沖溶液，預熱10 min后取3.0 mL 加入0. 3 mL粗酶液，在溫度30℃水浴中反應4 h，終止酶反應后測定甲基橙吸光度，并計算脫色率。由圖5可知，隨著甲基橙濃度的升高，擬康寧木霉胞內酶的酶促降解效果降低。這可能是因為甲基橙質量濃度增加，擬康寧木霉胞內酶受到抑制，酶促降解受到影響，甲基橙去除率逐漸下降。在低濃度情況下甲基橙的去除效率相對較高，故選取30 mg/L作為甲基橙反應的質量濃度。

圖5 甲基橙濃度對擬康寧木霉酶促降解效果的影響Fig. 5 Effects of methyl orange concentration on enzymatic degradation of Trichoderma koningii

2.5 pH對擬康寧木霉酶促降解效果的影響

配制含甲基橙質量濃度為30 mg/L的磷酸鹽緩沖溶液，使其pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，同2.4處理并計算甲基橙脫色率。由圖6可知：隨著時間的推移，pH較低時，甲基橙的脫色率不高；pH在5.0～7.0時，酶促降解效果逐漸增加，pH為7.0時，脫色率最大；當pH大于7.0時，去除率逐漸下降，當pH為8.5時，脫色率達到最低。過高、過低的pH都會影響酶的穩定性，進而使酶遭到不可逆性的破壞。故選取擬康寧木霉胞內酶在偏中性的條件下反應［17］。

圖6 pH對擬康寧木霉酶促降解效果的影響Fig. 6 Effects of pH on enzymatic degradation of Trichoderma koningii

2.6 溫度對擬康寧木霉酶促降解效果的影響

配制pH為7.0的含甲基橙質量濃度為30 mg/L的磷酸鹽緩沖溶液，取3.0 mL加入0.3 mL粗酶液，分別在溫度為20、25、30、35、40、45℃的水浴中反應，同2.4處理并計算脫色率。如圖7可見：當反應溫度小于30℃時，隨著時間的推移和溫度的增加，染料脫色效果顯著提高，反應溫度大于35℃后，脫色率急劇下降；溫度在25～35℃時，脫色率較高，在25℃時達到最大。以上結論說明，擬康寧木霉的酶促降解必須在適宜的溫度范圍內才能擁有較高的酶活力，溫度過高會導致酶失活，溫度過低容易使酶的活性受到抑制，影響甲基橙的去除效果，而該酶能在25～35℃范圍內保持較高的脫色率，說明該酶能在較寬的溫度范圍內保持較高的活性。

圖7 溫度對擬康寧木霉酶促降解的影響Fig. 7 The effects of temperature on enzymatic degradation of Trichoderma koningii

2.7 酶液投加量對擬康寧木霉酶促降解效果的影響

預熱2.6中含甲基橙質量濃度為30 mg/L的磷酸鹽緩沖液3.0 mL，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL粗酶液，并在25℃水浴中反應，同2.4處理并計算脫色率。如圖8所示，隨著時間的推移，甲基橙的脫色率逐漸提高。當酶液投加量增多時，甲基橙的脫色率趨于穩定，甚至出現下滑。根據米曼公式，酶促反應速率和酶濃度成正比，適當增加酶液投加量可以提高擬康寧木霉對甲基橙的去除效果，但酶液投加過多會使擬康寧木霉的降解酶趨于飽和，因營養物質的限制，各降解酶之間的競爭加大，使得脫色率無法提升，甚至有所降低。

圖8 酶液投加量對擬康寧木霉酶促降解的影響Fig. 8 The effects of the dosage of enzyme solution on enzymatic degradation of Trichoderma koningii

2.8 擬康寧木霉酶促降解正交試驗

根據單因素試驗結果，確定了酶液投加量、溫度、pH為正交試驗的因素，設定了3個水平進行酶促反應，以脫色率為指標進行考察。

由表2可知，將影響酶促降解效果的因素按從大到小排列，酶液投加量＞反應溫度＞pH。由極差分析可知最優條件：酶液投加量為0.6 mL，反應溫度為25℃，pH為 7.0。

表2 擬康寧木霉酶促降解正交試驗表Tab. 2 Orthogonal experimental table for enzymatic degradation of Trichoderma pseudokoningii

2.9 擬康寧木霉酶促降解最適反應條件

在酶液投加量為0.6 mL，水浴溫度為25℃，pH為7.0，甲基橙初始濃度為30 mg/L的情況下反應，每隔一段時間檢測吸光度并計算甲基橙脫色率，觀察染料處理情況。由圖9可知，在最適條件下擬康寧木霉對甲基橙的酶促降解效果明顯，甲基橙的脫色率最高可達到85.48%。

圖9 最適條件下甲基橙酶促降解試驗Fig. 9 Enzymatic degradation of methyl orange under optimal conditions

2.10 擬康寧木霉酶處理甲基橙模擬廢水機理初步探索

真菌是通過自由基過程實現對污染物的化學轉化的，自由基反應具有高度非特異性。化學物的降解過程是準一級動力學方程。利用McKinney模式，在好氧反應過程中，基質的代謝過程是被基質的量所控制的，并且基質的代謝速度遵循一級反應動力學［18-20］。

對于一級動力學反應：

兩邊積分有：lnC0/C=kt+b（k為反應常數，C、C0分別表示t、t0時刻基質濃度）。

以ln（C0/Ci）對t作圖，得到一直線，由此來驗證擬康寧木霉菌降解甲基橙廢水反應為一級動力學反應（圖10）。

圖10 擬康寧木霉菌降解甲基橙模擬廢水動力學模型Fig. 10 Kinetic model of simulated wastewater degradation by Trichoderma koningii

根據最佳條件下試驗所得結果，以ln(C/C0)對t回歸，得

根據式（2），可以估計擬康寧木霉菌將甲基橙完全降解所需要的時間，以及降解到某一時刻甲基橙的質量濃度。擬康寧木霉菌處理甲基橙模擬廢水的動力學研究結果與數據表明，擬康寧木霉菌處理甲基橙廢水屬于一級反應動力學。

3 討論

本文在較佳培養條件下培養出擬康寧木霉，提取其胞內酶，通過研究初始甲基橙濃度、pH、反應溫度、酶液投加量對甲基橙酶促降解的單因素和正交試驗，得出擬康寧木霉胞內酶去除甲基橙廢水的最優條件：酶液投加量為0.6 mL，反應溫度為25℃，pH為 7.0。在最優條件下進行的最適試驗中甲基橙去除率可以達到85.48%，屬于一級反應動力學，相對于目前國內外報道的各種微生物應用于染料降解的脫色效率，本文的脫色效果較明顯，為染料廢水的酶促降解條件提供了參考。國外已有利用其他木霉降解亞甲基藍等染料的研究，但利用擬康寧木霉對偶氮染料脫色方面的研究較少，因此本研究有一定創新性。文中酶促降解的模擬廢水相對于實際生活的廢水存在成分簡單、污染物質過于單一等情況，下一步可通過改變馴化與培養條件使其擴展到吸附或降解其他污染物質，并對該菌的胞內酶降解其他偶氮染料的條件和機理進行試驗，擴大其廣譜性。最終把研究結果推廣應用于實際，還需利用傅氏轉換紅外線光譜分析儀（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）、液相色譜質譜聯用儀（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）等技術分析該菌株胞內酶使甲基橙偶氮鍵斷裂產生的芳香胺類降解產物如4-氨基甲基偶氮苯、2，4-二氨基甲苯等［21-23］，進一步推測甲基橙的酶促降解途徑，為從試驗研究到工業化應用該菌種提供可靠的試驗依據和相應的技術參考，實現該菌種處理相關染料廢水的規模化應用。