高粱全基因組NRT1基因鑒定、表達與DNA變異分析

郭志強，梁月秀，馮 凡，朱立勛，范佳麗，姜曉東，呂晉慧，張春來

（山西農業大學農學院，國家功能雜糧技術創新中心，山西省旱作栽培與作物生態重點實驗室，山西省黃土高原特色作物高效生產協同創新中心，太谷 030801）

高粱（Sorghum bicolor）是世界上僅次于小麥、水稻、玉米和大麥的第五大糧食作物［1］，主要種植在干旱和半干旱地區，屬于短日照C4植物，具有抗旱、耐貧瘠和耐鹽堿等特性［2］，栽培面積較為廣泛。高粱基因組DNA測序工作初步在2009年完成，并于最近得到更新，這使得從基因組水平來揭示高粱重要基因家族的功能成為可能［3-4］。

植物氮利用率（nitrogen use efficiency，NUE）取決于植物的需求和植物對氮的吸收、運輸、積累和再分配。氮素作為植物生長發育過程中的必要元素之一，是植物體內生物大分子如蛋白質、葉綠素、核酸等的組成成分［5］。此外，氮素也是影響作物產量的因素之一［6］。氮供應水平影響植物葉片顏色、大小以及葉片數，進而影響植物對光的吸收能力，最終影響植物的生產力，特別是對于多葉蔬菜［6］。硝酸鹽（NO3-）是大多數植物中最重要的氮源。提高硝酸鹽吸收能力和植物氮利用率的重要步驟是識別負責硝酸鹽運輸的運輸者的特征，然后通過傳統的育種技術或基因工程操作來提高硝酸鹽吸收特性。近年來，對擬南芥、水稻等植物的營養研究表明，植物吸收轉運硝酸鹽的過程主要由4個蛋白家族成員介導完成，分別為硝酸鹽轉運蛋白1（nitrate transporter 1，NRT1）、硝酸鹽轉運蛋白2（nitrate transporter 2，NRT2）、氯酸鹽通道家族（chloride channel，CLC）以及慢離子相關通道同系物（slow anion channel- as- sociated homolog，SLAC/SLAH）［7］。除此之外，還有許多蛋白酶、激素等參與，它們相互作用構成了錯綜復雜的調控網絡［8-10］。

硝酸鹽轉運蛋白（nitrate transporter，NRT），又稱為寡肽轉運蛋白（peptide transport，PTR），在動物、植物、酵母、古生菌以及細菌基因組中都有發現，是一種依賴于質子、具有專一性、依賴能量的轉運蛋白。蛋白的質子依賴性PTR家族與ATP結合轉運蛋白（ATP-binding cassette，ABC）不同，是通過對最近發現的一些肽轉運蛋白進行序列分析而發現的［11］。這些蛋白質似乎主要參與小肽的攝取，同時還攝取質子［12］。

一些NRT也執行肽的運輸，有的還運輸抗生素，它們通過質子共運發揮作用，但底物對H+的化學計量學是可變的，如高親和力的大鼠PepT2載體分別催化中性和陰離子二肽攝取兩個和三個 H+，而低親和力的PepT1載體催化每個中性肽攝取一個H+［13］。

本研究對SbNRT1的基因結構、系統進化樹、基因表達、選擇進化及其蛋白質的理化性質、亞細胞定位、二級和三級結構進行了分析，為NRT1基因調控提供一定的理論基礎與試驗依據。

1 材料與方法

1.1 基因檢索

以水稻（Oryza sativa）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）的NRT1氨基酸序列作為參考，在Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）和 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中進行Blast搜尋和比對，獲得SbNRT1基因家族的基因序列、編碼序列（coding sequence，CDS）、氨基酸序列。小麥（Triticum aestivum）與甜菜（Betavulgaris）的NRT1蛋白質序列來自NCBI；藜麥（Chenopodium quinoa Willd）、玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）、谷子（Setaria italic）的NRT1蛋白質序列來自Ensembl Plants數據庫（http://plants. ensembl. org/index.html）。

1.2 生物信息學分析方法

采用Gene Structure Display Sever數據庫（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）［14］分析基因的結構 ；采用 Ex-PASY-ProtParam tool數據庫（http://web.expasy.org/protparam）對蛋白質的理化性質進行分析；采用Sig-nalP-5.0 Server數據庫（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測蛋白質是否含有信號肽；采用PSORT數據庫（psort1.hgc.jp/form.html）對蛋白質進行亞細胞定位分析預測。

采用SOPMA數據庫（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html）對蛋白質二級結構進行預測，采用Phyre2數據庫（www.sbg.bio.ic.ac.uk/）進行蛋白質三級結構模型的預測，采用Ramachandran Plot Analysis數據庫（http://mordred.bioc.cam.ac.uk/）檢驗蛋白質三級結構預測的準確性。

利用 MEGA 7［15］軟件對序列進行 Clustal W［16］比對，然后再使用鄰接法（neighbour joining，NJ）構建系統進化樹。利用已發表的SbNRT1基因表達Atalas數據［17-18］，在phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中獲取目的基因在高粱各個生育期、不同器官部位的表達量，再利用Heml軟件作出表達量的熱圖。利用MEGA 7軟件對CDS序列進行比對，再利用TBtools軟件計算出基因的進化選擇壓力。

2 結果與分析

2.1 SbNRT1基因家族基本信息

利用Phytozome和NCBI數據庫進行篩選，結合高粱各組織的轉錄組測序數據，得到SbNRT1基因20個（表1）。SbNRT1基因長度為1 762～12 364 bp，分布在第SBI-01、SBI-02、SBI-03、SBI-04、SBI-05、SBI-06、SBI-07、SBI-09、SBI-10共9條染色體上，每個SbNRT1基因都有一個或多個轉錄本。本研究選用的為初級轉錄本蛋白，具體蛋白質的編號如表1所示。

表1 SbNRT1基因家族基本信息Tab. 1 Basic information for the SbNRT1 gene family

2.2 SbNRT1基因結構分析

SbNRT1基因結構分析顯示：絕大多數SbNRT1均存在上下游非編碼區，但其長度均比較短；CDS為編碼蛋白產物的序列，大部分基因CDS數量很少，在3～4個之間，小部分基因CDS數量在5～8個之間 ；其中Sobic.001G133900、Sobic.001G276600、Sobic.007G044300、Sobic.010G175900等基因的內含子較長，由于外顯子與內含子接頭區存在一段高度保守的一致序列，這幾個基因相對其他SbNRT1存在更多的高度保守序列數量（圖1）。

圖1 SbNRT1基因結構Fig. 1 SbNRT1 gene structure

2.3 SbNRT1蛋白質理化性質

由表2可知：SbNRT1蛋白質氨基酸數目在250～667個之間；分子量大小在26 334.30～72 337.95 Da之間；理論等電點在5.72～9.53之間，大部分SbNRT1蛋白質等電點大于7；不穩定系數分析表明，14個SbNRT1蛋白為穩定蛋白，6個Sb-NRT1蛋白為不穩定蛋白（不穩定系數>40）；脂溶系數的高低決定了蛋白質的流動性，系數越高，流動性越好，除Sobic.009G049900蛋白外，其余19個SbNRT1蛋白的脂溶系數均大于90，表明SbNRT1蛋白的流動性較好；親水性平均值都大于0，表明Sb-NRT1蛋白質均為疏水性蛋白［19］。

表2 SbNRT1蛋白質理化性質Tab. 2 The physical properties of SbNRT1 proteins

2.4 SbNRT1蛋白質信號肽及亞細胞定位分析

根據蛋白質信號肽分布，Sobic.004G260500、Sobic.006G251200、Sobic.007G044300、Sobic.007G081300、Sobic.009G049900、Sobic.010G099700這6個蛋白質信號肽分值（signal peptide score，S）均>0.5，表明蛋白含信號肽，為分泌性蛋白；剩余的蛋白信號肽剪切位點分值（cut score，C）、綜合剪切位點分值（synthetical cut score，Y）均<0.5，表明蛋白都不含信號肽，不是分泌性蛋白。蛋白質亞細胞定位預測顯示，有17個蛋白定位在質膜上，概率區間為60%～82%，有3個蛋白定位在葉綠體類囊體膜上，概率分別為94.8%、93.9%和66.4%（表3）。

表3 SbNRT1蛋白質亞細胞定位Tab. 3 Subcellular location of SbNRT1 proteins

2.5 SbNRT1蛋白二級結構分析

SbNRT1蛋白家族的二級結構主要由α-螺旋和無規則卷曲構成（二者在蛋白質中所占氨基酸數量的比例大于70%），而延伸鏈（β-折疊的組成結構）、β-轉角比例較低（表4）。由此可以推測出，α-螺旋和無規則卷曲是SbNRT1蛋白的大量結構元件，而延伸鏈和β-轉角則散布在整個蛋白質中。

表4 SbNRT1蛋白二級結構分析Tab. 4 Analysis of the secondary structure of SbNRT1 protein unit: %

2.6 SbNRT1蛋白三級結構模型

采用phyre 2軟件預測高粱NRT1蛋白的三級結構，結果顯示，NRT1蛋白三級結構主要由α-螺旋和無規則卷曲構成，與二級結構預測結果一致（圖2）。采用Ramachandran plot analysis軟件評估建模模型，結果顯示，氨基酸殘基所處的最佳區域比例為63.00%～88.50%，可接受區域氨基酸殘基比率為8.90%～32.80%，SbNRT1蛋白質三級結構模型的可信度均大于93.00%（表5）。

表5 SbNRT1蛋白質三級結構模型評估Tab. 5 Evaluation of tertiary structure model of SbNRT1 protein unit: %

圖2 SbNRT1蛋白質三級結構模型Fig. 2 Tertiary structure models of SbNRT1 proteins

2.7 SbNRT1基因系統進化樹分析

SbNRT1基因的系統進化樹分析表明，Sb-NRT1基因進化樹的變異值為0.1，高粱各基因間相互存在同源性，但大部分基因同源性不高。其中Sobic.001G302800與Sobic.004G193000，Sobic.003G185100與Sobic.007G044300，Sobic.001G133900與Sobic.009G148900等旁系同源序列的同源性較高（圖3）。對高粱、擬南芥、大豆、玉米和谷子的NRT1基因家族進行聚類分析（圖4），不同顏色范圍代表不同亞族，結果表明：NRT1基因家族分為8類，即8個亞族，Sobic.004G260500與Zm00001eb189000，Sobic.002G091800與Zm00001eb304390，Sobic.010G099700與Zm00001eb371840、KQL10112，Sobic.003G399200與KQL15490、Zm00001eb025860，Sobic.003G107100與Zm00001eb126980互為直系同源基因，說明高粱與谷子、玉米的NRT1基因在進化過程中同源關系更近；進化樹中的雙子葉植物（大豆、擬南芥）與單子葉植物（高粱、玉米和谷子）大多不能聚集在同一分支下，說明NRT1基因在進化過程中出現單雙子葉的分化。

圖3 SbNRT1基因家族聚類圖Fig. 3 Clustering of SbNRT1 gene family

圖4 高粱、玉米、擬南芥、大豆、谷子的NRT1基因家族的系統進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of NRT1 gene family in Sorghum bicolor, Zea mays L., Arabidopsis, Glycine max (Linn.) Merr, Setaria italica

2.8 SbNRT1基因表達

利用高粱表達Atalas數據構建表達量熱圖（圖5），可知SbNRT1基因的表達具有時空專一性。Sobic.010G175900、Sobic.010G099700、Sobic.009G148900、Sobic.009G049900、Sobic.007G160900等基因在整個高粱生育期表達很低；Sobic.003G295500在整個生育期表達水平較低 ；但是Sobic.001G133900、Sobic.004G193000、Sobic.001G302800在生育期某個階段表達水平比較高，其中，Sobic.004G193000在生育期多個部位表達水平較高，尤其在左下生長花期表達水平最高，Sobic.001G302800在左葉、葉鞘生長花部位表達水平較高。從SbNRT1基因整個表達時期可以看出，表達水平由高到低依次為左下生長花期、葉片、莖中部節間、根部。

圖5 SbNRT1基因家族表達熱圖Fig. 5 Heat map for expression of SbNRT1 gene family

在高粱根部Sobic.001G133900的表達受銨鹽和尿素誘導，受硝酸鹽誘導表達最強的為Sobic.001G133900、Sobic.003G295500和Sobic.001G302800，而Sobic.003G295500似乎僅在硝酸鹽誘導下表達。

2.9 SbNRT1進化選擇分析

在遺傳學中用非同義突變率（non-synonymous mutation rate，ka）與同義突變率（synonymous mutation rate，ks）的比值作為這個蛋白質編碼基因是否有選擇壓力作用的標準。如果ka/ks遠大于1，則存在正選擇效應；如果ka/ks=1,則認為存在中性選擇；如果ka/ks遠小于1，則存在純化選擇作用。通過對Sb-NRT1同源蛋白基因對的進化選擇壓力分析，得出SbNRT1蛋白編碼區基因的ka/ks遠遠小于1，說明SbNRT1蛋白質編碼基因存在純化選擇作用（表6）。

表6 SbNRT1進化選擇參數Tab. 6 SbNRT1 evolutionary selection parameters

3 討論

高粱抗旱性和耐鹽性強，在貧瘠土壤上種植也能有一定的收成，是典型的“環境友好型”作物，是研究作物抗逆性的模式植物之一。由于高粱抗逆境能力比其他作物更強，所以越來越多的植物科學家將研究的重點轉移到了高粱上，而其中轉運蛋白基因的挖掘更是成為一個新的研究熱點。目前Sb-NRT1基因的鑒定和系統分析尚未見報道。本研究從全基因組水平上對SbNRT1基因家族進行鑒定，并進行了表達分析和DNA選擇分析，為研究其功能、建立分子標記輔助育種奠定了基礎。

本研究結果表明：高粱全基因組內鑒定出SbNRT1基因共有20個，分布在SBI-01、SBI-02、SBI-03、SBI-04、SBI-05、SBI-06、SBI-07、SBI-09、SBI-10共9條染色體上；SbNRT1蛋白質均為疏水性蛋白，且理論等電點大于7；6個SbNRT1蛋白為不穩定蛋白，14個SbNRT1蛋白為穩定蛋白；75%以上的SbNRT1蛋白質不存在信號肽，不是分泌性蛋白，這與大多數SbNRT1蛋白亞細胞定位在質膜上的結果表現一致；SbNRT1蛋白質的二級結構主要是α-螺旋和無規則卷曲；SbNRT1蛋白質的三級結構比較復雜，但模型可信度均大于93%。

系統進化樹分析結果表明，SbNRT1蛋白家族分為8個亞家族，高粱與玉米、谷子的NRT1蛋白質在進化上同源關系更近。此結果與葉玲等［20］對谷子NRT2基因家族生物信息分析結果一致。從表達熱圖上可以分析得出，SbNRT1基因表達具有較強的器官、生育期特異性，尤其以Sobic.004G193000基因表達水平較高。在高粱根部受硝酸鹽誘導表達最強的基因為Sobic.001G133900、Sobic.003G295500和Sobic.001G302800，前者也受銨鹽和尿素誘導，而Sobic.003G295500似乎僅在硝酸鹽誘導下表達。以上結果為研究基因功能及氮肥響應提供了分子基礎。

對SbNRT1基因的表達進行分析有助于進一步鑒定轉運蛋白相關基因，為高粱相關基因的進一步鑒定與功能研究奠定理論基礎，為后續分子育種提供思路，也為揭示該基因家族參與植物氮素吸收利用的調控機制提供了理論依據。