casper斑馬魚體色觀察及過表達mitfa對其體色發(fā)育的影響

張廣婧，王 梅，劉利生，張永勤，彭亮躍，劉文彬，肖亞梅，劉錦輝

（省部共建淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室，湖南師范大學生命科學學院，長沙 410081）

魚類主要通過幾種色素細胞將色素保留在細胞內從而形成特定的圖案和體色［1-3］。魚類的不同體色主要取決于鱗片和皮膚含有的色素細胞及其不同的數(shù)量分布，魚鰭和鱗片都是皮膚的衍生物，所以魚類的體色觀察常以魚鰭和鱗片為材料［4］。在魚類中色素細胞有黑色素細胞、黃色素細胞、紅色素細胞、虹彩細胞、白色素細胞和藍色素細胞六種［5-6］。2017年，林金杏等［7］研究報道了野生型斑馬魚體表有黑色素細胞、黃色素細胞和虹彩細胞三種類型色素細胞，但鰭和鱗片在色素細胞組成和分布上存在著差異，鱗片中色素細胞的種類和形態(tài)特征較鰭中色素細胞更豐富。目前，對于硬骨魚類體色的報道鮮少，尤其是斑馬魚其他品系。nacre斑馬魚品系［8］由mitfa基因突變而來，而roy orbin斑馬魚品系［9］則是因為編碼線粒體內膜蛋白的mpv17基因內含子缺陷所導致的。casper突變體是一種nacre與roy orbin雜交選育得到的雙基因突變斑馬魚品系（mitfaw2/w2;roya9/a9）［10-11］。casper斑馬魚的特點是全身透明無黑色素細胞，是較為優(yōu)選的魚類試驗材料，但對于其體色的研究資料尚未完善。

處在真皮層的黑色素細胞在特定的細胞器——黑素體中將酪氨酸通過酪氨酸酶的作用氧化成多巴，隨后發(fā)生異構化和脫羧等作用，生成為5，6-二羥基吲哚（5，6-dihydroxyindole，DHI），再經(jīng)過一系列復雜的氧化反應最終產(chǎn)生吲哚聚合體，即黑色素［10］。小眼畸形相關轉錄因子（microphtalmiaassociated transcription factor，MITF）的基因在斑馬魚中存在mitfa和mitfb兩個亞型，mitfa是檢測具有多種分化潛能的神經(jīng)嵴細胞轉變成為黑色素細胞時的標記基因之一，并且在黑色素細胞分化、遷移的過程中發(fā)揮著決定性的作用［13-14］。已有研究表明：Wnt基因主要與黑色素細胞的分化有關，參與早期神經(jīng)嵴細胞分化成黑色素細胞；Wnt 通路主要是通過上游基因系列反應，使β-catenin在細胞內積累，稍后通過與LEF（lymphoid enhancing factor）結合，啟動LEF與MITF轉錄因子的結合位點，進而激活MITF的表達，促進黑色素細胞的分化或黑色素的生成［15］。mitfa基因一方面受MC1R/ASIP/a-MSH、Wnt/β-Catenin及c-Kit/SCF信號通路的調節(jié)，另一方面通過bHLHZip結構域與酪氨酸基因家族啟動子的E-box以及M-box (CAT-GTG)結合后激活相關基因的表達，進而影響黑色素的生成［16-17］。而且MITF還能影響周期素依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，cdk2）、T-box 轉錄因子2（T-box transcription factor 2，tbx2）和周期素依賴性激酶抑制因子p21等來調控黑色素細胞的生長發(fā)育［4］。2005年，姚紀花等［18］的研究中干擾了mitfa基因，導致體表黑色素細胞減少。除此之外，較多的研究表明mitfa的突變都會導致黑色素細胞發(fā)生變化。但對于mitfa基因的過量表達并未有相關報道。因此，本研究通過在casper透明斑馬魚中過表達mitfa基因，同時觀察比較分析野生型斑馬魚、casper斑馬魚以及過表達mitfa的casper斑馬魚之間在體色發(fā)生的不同時期和不同組織中色素細胞的差異變化，探討mitfa基因的表達與斑馬魚體色變異的關系，從而為魚類體色變異的分子機制研究和觀賞魚類品種體色遺傳選育改良提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用野生型AB斑馬魚（Danio rerio）和casper斑馬魚均來自中科院水生所國家斑馬魚資源中心。

1.2 野生型斑馬魚和casper斑馬魚魚鰭、鱗片的取樣與色素細胞的觀察

將野生型斑馬魚和casper斑馬魚用MS-222麻醉后，使用經(jīng)75%酒精消毒后的手術剪刀于體視顯微鏡下分別完整剪取臀鰭和背鰭，并用消毒過的鑷子輕輕夾取鰭條基部附近的鱗片。因斑馬魚鰭條與鱗片較薄且透明，在經(jīng)過生理鹽水清洗干凈后，可置于載玻片上制成臨時玻片，使用體視顯微鏡觀察玻片并對色素細胞的形態(tài)和分布進行記錄。

1.3 casper斑馬魚胚胎的獲取與其早期發(fā)育過程體色的觀察

取性成熟的casper斑馬魚，將雌魚和雄魚分別置于催產(chǎn)盒中，并用隔板隔開，避光置于28.5℃下過夜。第二天早上給予光照刺激并撤去隔板，待產(chǎn)卵后，收集得到胚胎。將胚胎清洗后在體視顯微鏡下觀察其在不同胚胎發(fā)育過程中以及幼苗出膜后體色的變化。

1.4 mitfa基因的過表達

首先使用HiPure Total RNA Midi Kit RNA提取試劑盒（Magen公司，R4124）進行斑馬魚胚胎RNA的提取，再用反轉錄試劑盒（TAKARA公司，RR047A）進行反轉錄得到斑馬魚cDNA。根據(jù)NCBI基因庫中上傳的斑馬魚mitfa基因序列（NM_130923）篩選得到其MITF的蛋白編碼區(qū)（coding sequence，CDS）比較過表達所選擇的質粒載體與基因序列，篩選得到Hind III與NheI雙酶切位點。使用引物設計原則在CDS區(qū)上下游兩端設計帶有人工添加酶切位點的引物。以反轉錄得到的斑馬魚cDNA為模板，加入設計的引物，進行PCR擴增，得到目的片段。將其與p-Tol2-EGFP質粒載體進行連接得到重組質粒p-Tol2-mitfa過表達重組質粒。在顯微注射儀上將所構建的過表達質粒顯微注射casper斑馬魚胚胎，顯微注射的質粒的質量濃度控制在100～200 ng/μL之間，并且注射p-Tol2-EGFP質粒載體作為對照，之后在熒光顯微鏡下觀察質粒的表達情況。

2 結果與分析

2.1 casper斑馬魚體色的色素細胞觀察

野生型斑馬魚的魚鰭分為具有條紋的魚鰭和無條紋的魚鰭兩種，例如，臀鰭和尾鰭具有條紋，而背鰭、胸鰭、腹鰭沒有條紋。本文分別選擇了具有條紋的臀鰭和無條紋的背鰭的野生型（wild type，WT）斑馬魚與casper斑馬魚進行對比觀察（圖1）。在顯微鏡下觀察到casper斑馬魚的臀鰭處由黃色和橙黃色的黃色素細胞疏密分布形成黃色條紋（圖2a），背鰭上則均勻地分布著大量黃色素細胞（圖2b），而casper斑馬魚背部鱗片中，僅可見部分黃色素細胞，而無黑色素細胞（圖2c）。此外，觀察到野生型斑馬魚與casper斑馬魚在體色上存在顯著的差異，但無論是野生型斑馬魚還是casper斑馬魚，黃色素細胞在背鰭上呈顆粒狀，在背部鱗片上呈現(xiàn)出樹突狀。

圖1 野生型斑馬魚和casper斑馬魚臀鰭、背鰭、背部鱗片觀察點Fig. 1 Observation points of wild-type zebrafish and casper zebrafish anal fin, dorsal fin, and back scales

圖2 野生型斑馬魚和casper斑馬魚臀鰭、背鰭、背部鱗片色素細胞觀察Fig. 2 Observation of pigment cells in anal, dorsal and dorsal scales of wild-type zebrafish and casper zebrafish

2.2 casper斑馬魚早期體色發(fā)育的觀察

比較野生型斑馬魚與casper斑馬魚（圖3），發(fā)現(xiàn)兩者在發(fā)育過程中形態(tài)結構無顯著差別，在體色發(fā)育過程中明顯觀察到野生型斑馬魚有黑色素細胞的分布以及產(chǎn)生的系列變化（圖3紅箭頭所指），而在casper斑馬魚中其體色大多數(shù)是由黃色和橙黃色的黃色素細胞疏密分布形成黃色條紋，并未觀察到黑色素細胞的存在。

圖3 野生型斑馬魚與casper斑馬魚早期體色發(fā)育觀察Fig. 3 Observation of early body color development of wild-type zebrafish and casper zebrafish

2.3 過表達mitfa的casper斑馬魚早期體色發(fā)育觀察

首先，獲得斑馬魚的總cDNA。比較過表達所選擇的質粒載體與基因序列，在CDS區(qū)上下游兩端設計帶有人工添加酶切位點（Hind III與NheI雙酶切位點）的引物，通過PCR擴增得到mitfa基因（帶有雙酶切位點）目的片段（大約1.3 kb）。將其與p-Tol2-EGFP質粒載體進行連接得到p-Tol2-mitfa過表達重組質粒（圖4a）。使用顯微注射的方式將p-Tol2-mitfa過表達重組質粒注射進casper斑馬魚一細胞期的胚胎，進行三次重復試驗。每次注射對照組（注射p-Tol2-EGFP質粒載體）和試驗組（注射p-Tol2-mitfa過表達重組質粒）所用胚胎都在200枚左右，胚胎存活率達到95%左右，重組質粒成功進入胚胎且過表達的效率在70%左右（表1），最終得到過表達mitfa的casper斑馬魚。將注射p-Tol2-EGFP質粒載體的casper斑馬魚一細胞期胚胎作為對照，發(fā)現(xiàn)兩者在發(fā)育時期形態(tài)特征并未有差異（圖4b），但體色方面與對照組不同的是，過表達mitfa的casper斑馬魚孵化后2天（2 days post-hatching，2 dph）在頭背部、腹部與軀干部（紅箭頭所指）有樹突狀和顆粒狀的黑色素細胞重新形成，并且在50 dph時黑色素細胞一直存在（圖4c）。

圖4 casper斑馬魚mitfa過表達Fig. 4 mitfa overexpression of casper zebrafish

表1 胚胎注射情況統(tǒng)計Tab. 1 Embryo injection statistics

3 討論

魚類具有豐富多彩的體色，這在躲避敵害、覓食、求偶交配等種群繁衍中發(fā)揮著重要作用，并且蘊藏著十分可觀的生態(tài)學和經(jīng)濟學效益［2-3］。色素細胞是魚類形成五彩斑斕的色素斑圖與體色的基礎，不同的色素細胞種類、數(shù)量和分布通過影響特定波長光的吸收和反射，從而產(chǎn)生特定的體色［16］。黑色素細胞在魚類生理性體色變化中起主要作用，所以目前對于黑色素細胞的研究最為廣泛［19-20］。斑馬魚作為試驗模式動物，被廣泛應用于各種生物學科研究。在前期文獻報道中，野生型斑馬魚眼部和頭背部黑色素細胞呈樹突狀、顆粒狀、團狀和彌散狀［7］。本研究以斑馬魚的體色特點作為對照，發(fā)現(xiàn)野生型斑馬魚與casper斑馬魚在胚胎和幼苗的形態(tài)結構上并未有太大的差異，而在組織細胞層面和早期體色發(fā)育過程中存在著顯著差異。在casper斑馬魚中發(fā)現(xiàn)其體色大多數(shù)為黃色和橙黃色細胞，并無黑色素細胞。casper斑馬魚的臀鰭處是由黃色和橙黃色的黃色素細胞疏密分布形成黃色條紋，背鰭上則均勻地分布著大量顆粒狀黃色素細胞，而背部鱗片中，僅可見部分黃色素細胞，并且黃色素細胞均呈現(xiàn)出樹突狀分布。casper斑馬魚不僅是魚類體色發(fā)育研究重要材料，而且因成體透明，在顯微鏡下可直接示蹤觀察細胞。透明斑馬魚casper突變體的構建，極大地推動了成年斑馬魚移植模型可視化的發(fā)展。在casper斑馬魚體內植入RAS-黑色素瘤細胞，5 d后即可觀察到腫瘤的移植、擴增和遠距離轉移［17］。這為脊椎動物的干細胞移植和癌癥體內研究提供了材料平臺，在神經(jīng)科學、干細胞移植和腫瘤研究中有極大的應用。

mitf基因在斑馬魚中存在mitfa和mitfb兩個亞型，mitfa與黑色素細胞形成密切相關，而mitfb只與眼視網(wǎng)膜色素上皮的發(fā)育有關［13-14］。mitfa的表達受到Ednrb、Wnt及Kit/SCF信號通路的調控，其翻譯得到的MITF通過自身的堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈結構域可以與酪氨酸基因家族啟動子結合，從而激活相關基因如酪氨酸酶、多巴素異構酶、酪氨酸酶相關蛋白-1等基因的表達，進而影響黑色素的生成［17］。本研究通過在casper斑馬魚中過表達mitfa基因，發(fā)現(xiàn)黑色素細胞在斑馬魚幼魚時期就有表達，并且在50 hfp后黑色素細胞還一直存在。黑色素細胞的形成受一系列信號通路和基因的嚴格調控，其中，MC1R/α-MSH 信號通路、PI3K/Akt 信號通路、MAPK 信號通路、WNT /β-catenin 信號通路、NO 信號通路為最常見的5條信號通路［21-22］。mitfa基因作為這5條通路共有的靶向基，其過量表達具體參與哪條通路進而影響黑色素細胞的出現(xiàn)需進一步探索。前期研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚黑色素細胞與黃色素細胞來自于同一前體干細胞，且mitfa基因還參與虹彩細胞的發(fā)育過程。但本研究發(fā)現(xiàn)原本黑色素細胞缺失的casper斑馬魚在頭背部以及腹部有樹突狀與顆粒狀黑色素細胞的產(chǎn)生，且黃色素細胞和虹彩細胞沒有變化［23］。mitfa基因參與黃色素細胞和虹彩細胞的調控需要進一步的研究。本研究得到的過表達mitfa的casper斑馬魚為深入開展魚類體色分子調控機制研究提供了材料平臺。mitfa作為黑色素相關的關鍵基因，其研究對黑色素細胞本身和黑色素形成基因調控網(wǎng)絡的影響以及觀賞魚類新品種的選育、魚類資源的開發(fā)利用和保護均具有十分重大的意義。