ChIL-2-ChIL-4融合基因重組質粒遺傳穩定性研究

鄭龍龍 ，張 黎 ，郝思源，郝飛飛，白 瑞，霍乃蕊，鄭明學，譚 凡

（山西農業大學動物醫學學院，太谷 030801）

白細胞介素（Interleukin，IL）作為細胞因子的一員，是家禽機體固有免疫調節和特異性免疫啟動的關鍵信號。生物活性的IL-2和IL-4蛋白可通過增強目前常見的各類型商品化疫苗免疫反應的過程，誘導產生更加快速、高效、持久的中和抗體，作為一種新的免疫增強劑在疫苗研究領域受到廣泛研究與應用。

2018年，本課題組成員貢鑫等［1］成功構建了ChIL-2和ChIL-4的融合基因表達載體 pCI-ChIL-2-ChIL-4-EGFP，作為雞球蟲病三價四株早熟弱毒活疫苗的免疫佐劑。該載體表達分泌的ChIL-4-ChIL-2融合蛋白可增強雞球蟲病活疫苗的免疫保護力，降低活疫苗的副作用。

生物制品從微量的試驗階段進入商業化批量生產階段，最終進入復雜的田間應用階段，須驗證種質庫資源是否能夠保持安全、穩定、質量可控的狀態［2］。因此，本文通過研究DH5α/pUC57 pCIChIL-2-ChIL-4-EGFP重組菌的形態、生化特性、質粒丟失率、質粒超螺旋比、目的基因穩定性等指標，對后續大規模的生產研究及產品質量控制的建立提供試驗數據支撐，對潛在的田間應用具有指導性意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DH5α/pUC57 重組菌和 pCI-ChIL-2-ChIL-4-EGFP重組質粒由山西農業大學獸醫病理實驗室構建保存。EcoRI （TaKaRa，AGZ0312A）、SalI （Ta-KaRa，AGY1010A）、無內毒素質粒DNA小量抽提試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司，D629KA5985］、全波長酶標儀（Thermo Fisher Scientific， MultiskanTMFC )、 PCR儀(Bio-Rad，S1000TM）、內毒素檢測儀（安度斯生物有限公司，S-0704）。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組菌株傳代

DH5α/pUC57 重組菌使用接種環劃線接種于無菌37℃ 溶菌肉湯(lysogeny broth，LB )平板，避光倒置培養12 h，選取單個菌落混合10.0 mL含Amp＋（Ampicillin）的LB液體培養基，作為原始菌（0代）；抽取重組菌菌液0.5 mL混合于50.0 mL無菌LB Amp＋液體培養基，37℃避光220 r/min振蕩培養12 h，連續傳30 代。

1.2.2 重組菌株遺傳穩定性鑒定

取5×n（n=0～6）代重組菌，通過革蘭氏染色和特定糖發酵試驗鑒定重組菌的形態和生化特性。

1.2.3 重組菌純粹性檢驗

根據《中國獸藥典》純粹性檢驗方法［3］，無菌固體LB/GP斜面培養基試管涂布0.2 mL菌液，無菌條件下分別置于37℃和25℃避光培養。

1.2.4 重組菌分子生物學鑒定

由生工生物工程（上海）股份有限公司根據DH5α工程菌16S rDNA序列合成引物，F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R ：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′［4］。使用DNA提取試劑盒提取總DNA進行PCR擴增，擴增目標大小為1.2 kb的宿主菌序列，陽性產物進行基因測序。利用NCBI網站的BLAST在線工具進行序列比對，同源性大于95% 時判定為大腸桿菌屬［5］。

取5×n（n=0～6）代的重組菌菌液2.0 mL提取重組質粒，按酶切試劑說明書配置酶切體系，37℃水浴 15 min，酶切產物在120 V電壓下經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳20 min后進行檢測。通過Image Lab 4.1軟件計算重組質粒的超螺旋體質粒及各類質粒構型的圖像像素點的比值，得出超螺旋體質粒在總質粒量的百分比；并對質粒目的片段進行測序，測序結果與ChIL-2和ChIL-4基因比對。

1.2.5 重組質粒丟失率檢測

參考吳昊［6］完善的檢測DH5α/pUC57 重組菌質粒丟失率的方式，隨機選擇100個長勢良好的單個菌落，接種于含Amp＋的無菌LB 固體培養皿上，37℃條件下無菌培養12 h。統計無污染的目的菌落數量，按以下公式計算質粒丟失率：

質粒丟失率=（100-平板上菌落數）/100×100%。

1.2.6 重組質粒細胞轉染與表達效果測定

生物安全柜內吹打豬睪丸細胞（swine testis，ST)制成細胞懸液，每孔細胞培養板（24 孔）接種1.0×105個細胞，37℃、5% CO2進行培養， 貼壁率達到80%～90% 時進行細胞轉染，分為空白組、空載組、試驗組。棄掉培養液，用無血清DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）培養液洗2 次，V（重組質粒）∶V（HilyMax轉染試劑）=1∶3 緩緩混勻，室溫靜置15 min，混合物均勻加入細胞孔中。加入質粒后 37℃孵育4 h，替換無抗生素的含5%的胎牛血清DMEM培養基培養48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察陽性轉染細胞的綠色熒光信號（觀察時間<30 min）。以Image J軟件分析視野中綠色熒光的累積光密度值作為融合蛋白表達量的指標，綠色熒光信號的百分比平均值作為ST細胞的轉染率。

1.2.7 重組質粒表達產物生物活性測定

無菌分離10日齡無特定病原體（specific pathogen free，SPF）雛雞脾臟淋巴細胞，每孔1.0×107個細胞分裝入6孔板，然后每孔加入1.0 mg/mL ConA 40.0 μL培養48 h。離心收集細胞，用RPIM（Roswell Park Memorial Institute）1640培養基重懸細胞后，96孔板每孔加入2.5×105個細胞，空白組不加細胞；試驗組加入含質粒的ST細胞上清液50.0 μL；細胞對照組加入50.0 μL 空載體轉染細胞上清液；空白組加50.0 μL RPMI 1640+50 μL DMEM培養基。上述細胞在5% CO2、37℃培養36 h后，每孔加入四甲基偶氨唑鹽 （methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）10.0 μL混勻，常溫避光靜置孵育4 h，震蕩后混勻用全波長酶標儀測定波長490 nm處的光密度（optical density，OD）。MTT結果以刺激指數（lymphocyte stimulation index，SI）表示，SI的計算公式為 ：SI=（試驗組OD490nm-空白組OD490nm）/（細胞對照組OD490nm-空白組OD490nm）。

2 結果與分析

2.1 純粹性

DH5α/pUC57重組菌5×n（n=0～6）代接種硫乙醇酸鹽培養基小管與流體葡萄糖蛋白胨培養基小管，未見雜菌污染；菌落邊緣光滑，有特殊的光澤，呈顏色一致的灰白色半透明狀，培養基中未出現其他形態的菌落。

2.2 革蘭氏染色

革蘭氏染色DH5α/pUC57重組菌，5×n（n=0～6）代均為革蘭氏陰性（Gram negative bacillus，G-）短桿菌，形態無明顯差異，詳見圖1。

圖1 原代和30 代重組菌革蘭氏染色Fig. 1 Original and 30 generation recombinant bacteria gram staining

2.3 特定糖發酵

DH5α/pUC57重組菌5×n（n=0～6）代均接種乳糖生化管，培養基顏色為均一的紫色；接種葡萄糖生化管與甘露醇生化管，培養基顏色為均一的黃色；各組生化管內均沒有觀察到氣體產生，生化特性一致。具體情況見圖2。

圖2 重組菌糖發酵試驗Fig. 2 Sugar fermentation test of recombinant bacteria

2.4 質粒丟失率

挑取100個5×n（n=0～6）代DH5α/pUC57重組菌的單個菌落，接種于含Amp＋的LB 固體培養皿上，37℃條件下無菌培養12 h均形成單菌落，經計算質粒丟失率均為0。

2.5 分子生物學鑒定

2.5.1 DH5α工程菌16S rDNA 鑒定

以5×n（n=0～6）代總DNA為模板，根據DH5α工程菌16S rDNA序列合成引物，5×n（n=0～6）代均擴增出1.2 kb大小相似的片段（圖3）。使用5 000 bp DNA Marker作為參照，由圖3可知，5×n（n=1～6）代與原代擴增得到的條帶大小一致，說明目的片段在傳代過程中未丟失。

圖3 DH5α工程菌16S rDNA PCR鑒定Fig. 3 16S rDNA PCR identification of DH5α

2.5.2 質粒雙酶切及測序

DH5α/pUC57重組菌5×n（n=0～6）代的重組質粒經性能穩定的限制性內切酶EcoRI和SalI雙酶切鑒定，882 bp和4.7 kb附近出現固定的條帶（圖4），且質粒超螺旋比均大于90%。

圖4 重組質粒雙酶切鑒定Fig. 4 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid

2.5.3 DH5α 16S rDNA 和ChIL-2-ChIL-4基因測序結果

對DH5α/pUC57重組菌5×n（n=0～6）代16S rDNA PCR產物進行測序，結果采用NCBI網站中的BLAST在線工具與大腸桿菌進行同源性分析，結果顯示，各代次重組菌與大腸桿菌同源性均大于95%，詳見表1。5×n（n=0～6）代重組質粒中的目的片段與ChIL-2-ChIL-4基因序列100% 匹配。

表1 DH5α 16S rDNA 測序結果Tab. 1 DH5α 16S rDNA sequencing results

2.6 細胞轉染與表達效果

2.6.1 細胞轉染效果

各代次重組質粒轉染ST細胞48 h時，細胞轉染率無顯著差異（P>0.05），詳見圖5。

圖5 各代次重組質粒細胞轉染率Fig. 5 Transfection rate of each generation of recombinant plasmid

2.6.2 轉染細胞的融合蛋白表達效果

重組質粒在ST細胞內的ChIL-2-ChIL-4 蛋白表達量，在各代次之間無顯著性的差異（P>0.05），詳見圖6。

圖6 各代次蛋白相對表達量Fig. 6 Protein relative expression of each generation

2.7 表達分泌產物活性

各代次重組質粒在ST細胞中分泌表達的ChIL-2-ChIL-4 融合蛋白均能極顯著地（P<0.001）促進雞脾淋巴細胞增殖，且其促進雛雞脾臟淋巴細胞細胞增殖的能力無顯著差異（P>0.05），詳見圖7。

圖7 各代次蛋白刺激指數Fig. 7 SI of each generation of protein

3 討論

重組質粒的遺傳穩定性是實驗室高效表達生物活性物質商業化的主要阻力和限制性因素［7-10］。能否有條件形成工業化生產能力，提供足量可靠的表達產物是確定其應用規模的重要指標。重組質粒的存在對菌株的生長常造成一定的壓力，導致其生長特性可能發生變化。研究證實，培養體系加入一定的篩選壓力（如抗生素）可以顯著提高重組質粒的穩定性，避免雜菌的生長［11-14］。

DH5α重組菌連續快速迭代的過程中，質粒時常分裂延遲，造成重組菌丟失目的質粒。因此，驗證重組菌攜帶的質粒的穩定性是成功培養高質量重組工程菌的關鍵。本研究結果與Zhou等［15］試驗結果一致，0～30代重組菌菌落形態均勻一致，符合DH5α大腸桿菌的典型菌落特征，且染色鏡檢未發現雜菌污染。16S rDNA序列的同源性大于97%的細菌可認為是同一種屬［16-17］。本研究中的重組菌其16S rDNA序列同源性為98%～99%，說明重組質粒對宿主菌的生長無顯著的影響。質粒丟失率為0，說明未出現分裂不穩定性現象。研究表明，重組菌連續傳代30代仍能夠保證極高的菌株純粹性、不發生質粒丟失的現象，穩定的目的片段遺傳穩定性，且質粒超螺旋比均大于90%，目的片段與ChIL-2-ChIL-4基因序列100%匹配。

白介素類疫苗佐劑商品化的過程需要保證重組質粒的持久的遺傳穩定性，這對于基因佐劑的臨床應用及科學研究具有重要意義。本研究表明，攜帶ChIL-2-ChIL-4融合基因片段的DH5α/pUC57重組菌37℃傳代 30 次，重組質粒可保持較高的遺傳穩定性，能夠在大規模生產過程中保持細胞因子產物的均一性，具有作為雞球蟲活疫苗免疫佐劑的商品化臨床應用潛力。