2型糖尿病合并腹瀉患者腸道菌群與肝腎指標的相關性

熊 馨，李敏瑞，任玉艷，杜宇輝，賀建峰*

（昆明理工大學 a. 信息工程與自動化學院；b. 醫(yī)學院，昆明 650500）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致的血糖異常升高為主要特征的慢性代謝性疾病［1］，同時也是目前嚴重威脅人類健康和生命安全的非傳染性疾病之一［2］。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）占糖尿病患者90%以上，且其合并癥眾多。目前對于T2DM合并癥的研究有以下幾個方面：1）藥物治療對于T2DM合并癥的影響的分析，如陳晨等［3］研究發(fā)現(xiàn)，達格列凈可改善T2DM合并代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）患者的糖脂代謝指標；2）T2DM合并癥的相關性因素分析，如陳玉華等［4］研究發(fā)現(xiàn)，T2DM合并骨質疏松（osteoporosis，OP）受身體質量指數(shù)（body mass index，BMI）、總膽固醇（total cholesterol，CHOL）、降鈣素（calcitonin，CT）、骨鈣素（osteocalcin，OC）、25（OH）D3、抗胰島素抗體（insulin autoantibody，IAA）等因素影響；3）腸道菌群與T2DM合并癥的相關性分析等，如張榮芳等［5］研究發(fā)現(xiàn)，T2DM合并急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）大鼠腸道菌群結構發(fā)生改變，其中，大腸桿菌和雙歧桿菌的豐度與AP的嚴重程度相關。

T2DM胃腸道病變是威脅糖尿病患者健康的重要并發(fā)癥，占糖尿病患者的1/2左右［6-7］。腹瀉是T2DM患者常見的臨床癥狀之一［8-9］。患者出現(xiàn)腹瀉之后嚴重影響了其生活質量和對血糖水平的控制，并可能引起其他并發(fā)癥。有研究發(fā)現(xiàn)與單純的T2DM患者相比，T2DM合并腹瀉患者血糖水平更高，存在脂肪吸收不良、胃腸動力明顯紊亂的問題，但兩者的菌群失調情況沒有顯著性差異［10-11］。已有研究表明，腸道菌群組成與T2DM密切相關［12-18］。也有研究表明，糖尿病患者在治療過程中用藥對腸道菌群組成會造成影響［19-20］，且長期服用藥物會加重肝腎負擔。有研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調與肝腎功能具有相關性［21-22］。糖尿病患者本身由于代謝異常也會影響肝腎代謝，因此，糖尿病患者在定期的臨床試驗檢查中必須對血糖和肝腎功能進行檢測，以判斷患者在治療過程中血糖水平的穩(wěn)定性以及肝腎功能是否發(fā)生異常。本文研究T2DM合并腹瀉患者與T2DM患者腸道菌群和肝腎生化指標是否存在差異，并進一步探討兩類人群的腸道菌群與肝腎功能的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗數(shù)據(jù)源

本文的數(shù)據(jù)來自于2015—2017年云南省第一人民醫(yī)院內分泌科住院的T2DM患者。按照WHO1999年糖尿病診斷標準，根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結果，將T2DM患者劃分為單純的T2DM（26例，P組）和T2DM合并腹瀉（26例，D組）兩個組別。所有受試者均簽署了知情同意書，且該試驗得到了昆明理工大學倫理道德委員會的批準。所有研究對象均進行肝功能和腎功能檢查，且提供糞便樣本，以獲得腸道微生物。研究對象在采樣前1個月內未使用抗生素、益生菌或益生元等制劑及乳果糖。本文對52個樣本的腸道菌群α多樣性和β多樣性，以及血糖水平和肝腎生化指標數(shù)據(jù)進行分析。

1.2 肝腎生化指標測定

取52名患者的清晨空腹靜脈血5 mL，待血漿凝固后以3 500 r/min的轉速離心15 min，吸取血清，將分離得到的血清于-20℃保存。使用美國Beckman全自動大型生化分析儀（DXC800，LX20）測量谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）、間接膽紅素（indirect bilirubin，IBIL）、CHOL、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL_C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL_C）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（creatinine，Cr）、血尿酸（blood uric acid，UA）的血清水平。

1.3 腸道微生物DNA的提取和擴增

采集患者新鮮糞便樣本，在實驗室稱取約250 mg，分裝于EP管中，在-80℃冷凍保存。使用Qiagen的QIAamp Stool Mini kit試劑盒提取樣本中的細菌DNA，取提取產物1 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，分析DNA的完整性。之后，使用16S V4區(qū)域引物（515F/806R）進行PCR反應，擴增出V4～V5區(qū)域的16S rRNA基因。最后，將文庫在Illumina HiSeq 2000平臺上進行測序，生成了大小為1 796 bp的序列。

1.4 統(tǒng)計分析

本文的統(tǒng)計分析包含三個部分。首先，對于兩組患者的肝腎生化指標數(shù)據(jù)以及血糖檢測數(shù)據(jù)的差異采用單因素方差（one-way ANOVA）分析。其次，研究兩組患者的臨床生化指標與腸道微生物α多樣性指標的相關性，總共使用了三個α多樣性指數(shù)，分別為被觀察到的物種數(shù)（observed_species）、香農指數(shù)（shannon）、基于豐度的覆蓋估計值（abundance-based coverage estimator，ACE）。α多樣性反映了物種豐富度和均勻度以及菌群多樣性。為分析肝腎生化指標對腸道微生物α多樣性的影響，使用了一元一次線性回歸模型：

y=a+bx+e。

其中y為因變量，代表腸道微生物α多樣性；x為自變量，代表臨床生化指標。a為常數(shù)項，即回歸直線在y軸上的截距；b為回歸系數(shù)，即回歸直線的斜率；e為隨機誤差。

接下來，我們研究兩組患者腸道菌群結構在β多樣性測度上的差異。β多樣性反映了在生態(tài)距離上菌群組成的變化。β多樣性數(shù)據(jù)源為通過操作分類單位（operational taxonomic unit，OTU）的豐度信息表和OTU之間的系統(tǒng)發(fā)生關系計算得到的加權UniFrac和未加權UniFrac距離。使用PERMANOVA程序（R中Vegan包的adonis函數(shù)）進行置換多元方差分析，再根據(jù)未加權UniFrac距離進行主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA），得到主坐標分析圖。最后，用Spearman秩相關測試分析兩組患者肝腎生化指標與腸道微生物的相關性。

2 結果與分析

2.1 T2DM合并腹瀉和T2DM患者的臨床特征

如表1所示，研究對象的血糖檢測指標和肝腎生化指標包括以下幾個方面。糖尿病確診指標：糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin a1c，HbA1c），血糖（blood glucose，GLU），糖化血清蛋白（glycosylated serum protein，GSP）；肝功能指標：AST，ALT，TBIL，DBIL，IBIL；肝功能生化指標中反映肝臟合成蛋白質功能的指標：CHOL，TG，HDL_C，LDL_C；腎功能指標：BUN，Cr，UA。

在表1中，兩組患者的HbA1c、GLU、GSP水平普遍高于正常范圍（4%～6%，3.9～6.0 mmol/L，122～236 μmol/L），同時T2DM患者的檢測值均高于T2DM合并腹瀉患者，但二者沒有顯著性差異。在肝細胞損傷試驗和排泄功能試驗中，兩組患者的AST、ALT、TBIL、DBIL、IBIL都沒有超出正常范圍，但是T2DM合并腹瀉患者的AST水平明顯升高。在肝臟標記物中，兩組患者的TG水平存在顯著性差異（P=0.006），且T2DM患者的TG水平明顯超出正常范圍，除此之外兩組患者的HDL_C含量明顯偏低。在腎功能檢測值中，兩組患者的BUN水平存在顯著性差異（P=0.003）。

表1 糖尿病患者的臨床數(shù)據(jù)Tab. 1 Clinical data of diabetic patients

2.2 肝腎臨床特征和腸道微生物α多樣性之間的關聯(lián)

表2和表3總結了T2DM合并腹瀉和T2DM患者臨床生化指標與α多樣性的關聯(lián)結果［13，23］。在進行線性回歸分析之前，先進行了相關性分析，當差異具有顯著性（P<0.05）時，才認為兩個變量之間存在相關關系，最后進行回歸分析。在T2DM合并腹瀉組中，HbA1c水平作為糖尿病控制情況的標準，與observed_species和ACE指數(shù)負相關（P=0.038，r=-0.409；P=0.010，r=-0.496）。如圖1a所示，HbA1c增加與物種豐富度下降有關（P=0.038）；如圖1b所示，HbA1c增加也與菌群豐度下降有關（P=0.010）。TBIL、DBIL、IBIL水平與shannon指數(shù)負向相關（P=0.007，r=-0.514；P=0.038，r=-0.409；P=0.008，r=-0.510）；Cr水平與observed_species正向相關（P=0.012）（表2）。在T2DM組中，HbA1c、GLU、GSP水平反應糖尿病患者體內的血糖水平，與ACE和observed_species指數(shù)有關（P=0.034，r=0.416 ；P=0.046，r=0.394 ；P=0.027，r=0.433），且都為正向相關關系（表3）。所以，T2DM合并腹瀉患者的腸道菌群α多樣性與血糖指標中的HbA1c以及肝功能指標中的TBIL、DBIL、IBIL呈負相關，與腎功能指標中的Cr呈正相關；而T2DM患者的腸道菌群的α多樣性與血糖中的3個指標HbA1c、GLU、GSP均呈正相關，與肝腎指標不具有相關性。

表2 T2DM合并腹瀉患者肝腎臨床特征與α多樣性指標之間的關聯(lián)Tab. 2 The relationship between the clinical characteristics of liver and kidney and alpha diversity indexs in patients with type 2 diabetes with diarrhea

表3 T2DM患者肝腎臨床特征與α多樣性指標之間的關聯(lián)Tab. 3 The relationship between the clinical characteristics of liver and kidney and alpha diversity indexs in patients with type 2 diabetes

圖1 HbA1c與observed_species、ACE指數(shù)具有顯著相關性Fig. 1 HbA1c is significantly associated with observed_species and ACE index

2.3 T2DM合并腹瀉和T2DM患者腸道菌群β多樣性結構差異

通過16S rRNA測序得到1 796條OTU序列，在物種注釋之后OTU主要分為28個門（Phylum），55個綱（Class），108個目（Order），185個科（Family），408個屬（Genus），284個種（Species）。由于分類水平較低的種水平所表示的物種在高變區(qū)可能非常相近，能夠區(qū)分它們的特異性片段可能不在擴增區(qū)域內，因此大部分OTU序列注釋不到種水平，導致種的數(shù)目較少。同樣的原因，受到測序長度的限制，也導致了部分OTU序列在屬水平的物種注釋缺失，因此本文主要在門水平和科水平進行了后續(xù)分析。物種注釋后，在各個分類級別中按照細菌總讀數(shù)占總量大于1%的情況，鑒定了含量最豐富的細菌，包括7個主要的門，16個主要的綱，18個主要的目，以及15個主要的科。在門級別中，最豐富的細菌為厚壁菌門（Firmicutes，43.7%）、變形菌門（Proteobacteria，17.8%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，15.2%）、放線菌門（Actinobacteria，10.4%）。在綱級別中，最豐富的細菌為梭菌綱（Clostridia，34.7%）、擬桿菌綱（Bacteroidia，13.9%）。在目級別中，最豐富的細菌為梭菌目（Clostridiales，34.7%）、擬桿菌目（Bacteroidales，13.9%）。在科級別中，最豐富的細菌為瘤胃菌科（Ruminococcaceae，16.1%）、毛螺菌科（Lachnospiraceae，10.6%）。

圖2a和圖2b分別展示了在門水平上T2DM合并腹瀉和T2DM患者腸道中主要細菌的相對分布情況，其中厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門是兩類人群腸道中含量較大、分布較廣的細菌。圖2c和圖2d分別展示了在科水平上，兩類人群腸道中主要細菌的相對分布情況。其中，擬桿菌科（Bacteroidaceae）、毛螺菌科、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、瘤胃菌科是兩類人群腸道微生物中含量最多的細菌，并且T2DM合并腹瀉患者在前三種細菌的含量上比T2DM患者明顯降低，但瘤胃菌科和其他細菌的豐度明顯增加，韋榮氏菌科（Veillonellaceae）、紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）豐度也明顯比T2DM患者更高。

圖2 兩類人群分別在門級別和科級別中主要細菌的相對豐度分布Fig. 2 The relative abundance distribution of the main bacteria in Phylum and Family levels of the two populations

基于腸道微生物β多樣性距離測度分析兩類人群的菌群結構差異。選擇基于系統(tǒng)發(fā)育樹的加權UniFrac和未加權UniFrac距離度量，并使用R程序中Vegan包進行PERMANOVA檢驗群落結構差異，計算得到自由度（degree of freedom，Df）、平方和（sums of squares）、均方差（mean squares）、F檢驗值（F. Model）、方差貢獻（R2）、顯著性P值。如表4所示，使用置換檢驗進行顯著性統(tǒng)計時，兩類人群的腸道菌群組成結構在未加權UniFrac度量和加權UniFrac度量上都存在顯著性差異（P=0.001，P=0.006），具有統(tǒng)計學意義。基于未加權UniFrac距離進行主坐標分析，在計算PCoA時，首先對負特征根進行評估，即末尾的幾個軸，發(fā)現(xiàn)負特征根的絕對值較小，因此未對負特征值進行校正。再由斷棍模型評估各軸的特征值之后，選擇前兩軸進行映射作圖。如圖3所示，T2DM合并腹瀉（P組）、T2DM（D組）組間存在明顯差距，更充分說明PERMANOVA分析結果的可靠性。但從圖上也可看出兩組人群中有部分樣本存在聚集現(xiàn)象，說明這部分樣本人群的腸道菌群組成結構具有相似性。

表4 基于β多樣性距離測度的群落結構差異檢驗PERMANOVA分析Tab. 4 PERMANOVA analysis of community structure difference test based on β diversity distance measure

圖3 兩類人群基于UW-UniFrac距離的主坐標分析圖Fig. 3 Principal coordinate analysis diagram based on UWUniFrac distance for 2 groups of people

2.4 肝腎臨床特征與腸道菌群的相關性分析

T2DM合并腹瀉患者腸道菌群與肝腎生化指標的相關性分析如圖4a所示。瘤胃菌科與血糖檢測指標和肝腎生化指標都具有顯著相關性（P≤0.05），其中與HbA1c、GLU、GSP、TBIL、DBIL、IBIL、TG、Cr呈顯著正相關（r=0.54），與HDL_C呈顯著負相關（r=-0.60）；毛螺菌科與HbA1c、TBIL、DBIL、HDL_C、Cr呈顯著正相關（r=0.55，P≤0.05），與ALT、CHOL、TG呈顯著負相關（r=-0.54，P≤0.05）；擬桿菌科與HbA1c呈顯著正相關（r=0.58，P≤0.05），與GLU、AST呈顯著負相關（r=-0.52，P≤0.05）；產堿桿菌科（Alcaligenaceae）與GLU呈顯著正相關（r=0.55，P≤0.05），與CHOL呈顯著負相關（r=-0.56，P≤0.05）；普雷沃氏菌科與GLU呈顯著正相關（r=0.56，P≤0.05）。

T2DM患者腸道菌群與肝腎生化指標的相關性分析如圖4b所示。其中，瘤胃菌科和毛螺菌科在統(tǒng)計學意義上與血糖檢測指標和肝腎生化指標具有顯著相關性。毛螺菌科與HbA1c、GSP、TBIL、DBIL、IBIL、HDL_C、LDL_C、Cr呈顯著正相關（r=0.55，P≤0.05），與AST、ALT、CHOL、TG、UA呈顯著負相關（r=-0.56，P≤0.05）；瘤胃菌科與HbA1c、GLU、GSP、ALT、DBIL、Cr呈顯著正相關（r=0.56，P≤0.05），與HDL_C呈顯著負相關（r=-0.59，P≤0.05）；普雷沃氏菌科與GLU、BUN呈顯著正相關（r=0.59，r=0.63，P≤0.05）；產堿桿菌科與CHOL、HDL_C呈顯著負相關（r=-0.55，r=-0.59，P≤0.05）；Bacteroidales_S24-7_group與TBIL、DBIL呈顯著負相關（r=-0.54，r=-0.58，P≤0.05）；擬桿菌科與HbA1c、BUN呈顯著正相 關（r=0.57，r=0.58，P≤0.05），與UA呈顯著負相關（r=-0.55，P≤0.05）。

圖4 兩類人群在科水平上腸道菌群與肝腎生化指標相關性分析Fig. 4 Correlation analysis of gut microbiota and liver and kidney biochemical indexes in two groups of people in Family grade

所以，兩組人群腸道菌群含量最多的四種細菌，即擬桿菌、毛螺菌、普雷沃氏菌和瘤胃菌與血糖指標均呈正相關；兩組的瘤胃菌和毛螺菌與肝指標中的TBIL、DBIL、IBIL均呈正相關，與腎指標中的Cr正相關；且兩組的毛螺菌與TG負相關，T2DM合并腹瀉組的瘤胃菌與TG正相關；T2DM合并腹瀉組的這四種主要細菌與BUN均無關，但是T2DM組的擬桿菌和普雷沃氏菌與BUN均呈正相關。

3 討論

本研究首先對兩組人群的血糖檢測指標和肝腎生化指標進行了單因素方差分析，結果表明兩組人群的血糖水平無顯著性差異，這與梅堅［10］和范增順［11］的研究結果不一致；兩組的TG和BUN存在顯著性差異，其中腹瀉組的TG低于T2DM組，而BUN高于T2DM組，這是因為腹瀉患者脂肪吸收不良以及腎血流量減少，進而導致TG降低，BUN升高。之后對肝腎生化指標與腸道微生物α多樣性進行關聯(lián)分析，結果顯示T2DM合并腹瀉患者在TBIL、DBIL、IBIL水平上與群落多樣性呈負相關，在Cr水平上與菌群豐度呈顯著正相關。血清膽紅素（TBIL、DBIL、IBIL）是判斷肝細胞損傷程度的重要指標，肝細胞受損會引起直接膽紅素和總膽紅素偏高［24］。在此次研究中T2DM合并腹瀉患者和T2DM患者的TBIL、DBIL、IBIL含量都明顯偏高，但只有T2DM合并腹瀉患者的血清膽紅素水平與腸道微生物α多樣性顯著相關。除此之外，T2DM合并腹瀉患者的HbA1c水平與腸道菌群豐富度和多樣性下降有關，而T2DM患者的HbA1c、GLU、GSP水平與腸道菌群的豐富度和多樣性呈顯著正相關。這說明兩組患者的血糖水平與腸道微生物多樣性具有相關性。

對兩組人群的腸道菌群結構進行差異分析，發(fā)現(xiàn)二者的菌群結構在統(tǒng)計學意義上差異顯著（P=0.001，P=0.006），其主坐標分析圖如圖3所示。在門水平上，厚壁菌、變形菌、擬桿菌是兩類人群腸道中含量較高的細菌，這與徐峰等［16］研究一致。在科水平上，T2DM合并腹瀉患者在擬桿菌、毛螺菌、普雷沃氏菌的含量上比T2DM患者明顯降低，但瘤胃菌和其他細菌含量明顯增高。除此之外，兩類人群的腸道菌群與血糖水平和肝腎生化指標的相關性如圖4a和圖4b所示。兩組人群的四種細菌與肝指標中的TBIL、DBIL、IBIL呈正相關，與腎指標中的Cr正相關。其中腹瀉組的毛螺菌與TG負相關，瘤胃菌與TG正相關，說明腹瀉患者脂肪吸收不良，與腸道菌群的變化有關；腹瀉組的四種主要細菌與BUN均無關，但是T2DM組的擬桿菌和普雷沃氏菌與BUN均呈正相關，這說明腹瀉雖然導致患者的BUN升高，但是與四種主要菌群的變化無關。

糖尿病腹瀉的發(fā)病機制有多種，包括胃腸自主神經(jīng)病變、腸道菌群失調、胰腺外分泌不足、膽汁酸吸收障礙、胃腸激素分泌異常、肛門括約肌功能障礙等。有研究認為菌群失調不是導致糖尿病腹瀉的直接原因，而高血糖、自主神經(jīng)病變是相關因素［10-11］。而我們的研究表明，兩類人群腸道菌群結構差異顯著，其中T2DM腹瀉患者的擬桿菌、毛螺菌、普雷沃氏菌含量降低，而瘤胃菌含量升高。已有研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌、普雷沃氏菌可誘導促炎基因的表達，增加炎癥反應［25-27］，而瘤胃菌產生的短鏈脂肪酸能減少致炎因子的產生，同時刺激抗炎因子的增加［28］。近年相關研究認為，炎癥因子在糖尿病大血管病變中起到重要的作用［29］。高血脂、高血糖均會增加血管內皮細胞的通透性，引起血管內皮功能損傷，使得相關炎癥因子（如CRP、IL-6、TNF-α）水平紊亂，從而加劇血管內皮功能損傷，導致腎小管濾過功能受損［30］。糖尿病肝病的臨床癥狀較少且表現(xiàn)不典型，故常被忽視。但近年，糖尿病患者肝損傷的發(fā)生率越來越高，終末期肝病的死亡率也逐漸增加，糖尿病肝病引起了人們的重視［31］。范世宏［32］的研究表明，T2DM合并非酒精性脂肪肝患者的TG顯著高于對照組，炎癥因子水平TNF-α、IL-6、IL-10也顯著高于對照組，但是與單純T2DM組無顯著差異。因此，糖尿病腹瀉患者腸道菌群的變化是否能說明其炎癥因子水平較低，進而表明其肝腎損傷水平較低還需進一步研究。此外，糖尿病患者胃排空時間顯著延長，其中TG是胃排空延長的危險因素［33］。而我們的研究也表明，T2DM合并腹瀉組的TG顯著低于T2DM組，其中毛螺菌與TG呈負相關，瘤胃菌與TG呈正相關。因此，在后續(xù)的治療中可通過服用益生菌、糞便移植等方法調節(jié)腸道菌群結構，增加短鏈脂肪酸產生菌（如瘤胃菌等），抑制產生內毒素的細菌，如變形菌門的細菌等。

本研究的局限性是臨床病例有限，入組研究的樣本數(shù)量不夠大。此外，患者自身的生活習慣、其他病癥等都會對數(shù)據(jù)產生一定的影響。比如，梅堅［10］和范增順［11］的研究中T2DM合并腹瀉患者的血糖比T2DM患者高，但是本文的研究表明兩者的血糖并沒有顯著差異。因此，在后續(xù)的研究中將擴大樣本量，進一步驗證本文的結論。

綜上所述，T2DM合并腹瀉患者與T2DM患者的肝腎指標的TG和BUN存在顯著性差異，T2DM合并腹瀉患者的TG更低，BUN更高；兩者在腸道菌群結構上存在顯著性差異，其中T2DM合并腹瀉患者的擬桿菌、毛螺菌、普雷沃氏菌含量降低，而瘤胃菌含量升高；T2DM合并腹瀉患者血清膽紅素的升高與腸道菌群的物種多樣性的降低相關；兩組的毛螺菌和瘤胃菌與血糖指標和血清膽紅素均呈正相關，其中T2DM合并腹瀉患者的TG的降低與毛螺菌和瘤胃菌相關，而BUN的升高與四種主要菌群無關。研究表明，T2DM合并腹瀉患者的肝腎指標和腸道菌群結構與T2DM患者均存在差異，且肝腎指標與腸道菌群存在相關性，兩類患者可通過改善腸道內瘤胃菌的含量調整腸道菌群的平衡，從而為治療T2DM合并腹瀉患者提供新思路。