甲型流感H3抗原在畢赤酵母系統中的優化表達與純化

陳 溥，李安娜，湯巖松，龍浩雨，劉坤山，周 勉

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

流感是世界范圍內可以同時感染人和動物的傳染性疾病。流感病毒非常活躍，多次在流感季節“襲擊”全球，逐漸成為全球疾病防控的重點病毒之一。甲型流感病毒為最常見的流感病毒，并且最容易發生變異。甲型流感病毒的一些亞型如我們熟知的“禽流感”，病毒基因變異后能夠感染人類，感染后的癥狀主要表現為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數伴有嚴重的肺炎。嚴重者心、腎等多種臟器衰竭導致死亡，病死率較高。目前，我國每年仍會季節性地受到甲型流感的肆虐，嚴重危害畜牧業發展和人類健康。甲型流感對人類致病性高，曾多次引起世界性大流行。甲型流感病毒根據血凝素（hemaglutinin，HA）和神經氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性不同，又分為許多亞型，HA可分為17個亞型（H1～H17），NA有10個亞型（N1～N10）。1918年以來，HA的2個亞型（H1和H3）一直在人群中流行，導致高發病率和高死亡率［1-2］。

甲型流感H3N2是導致人類感染死亡的最主要的毒株之一，而目前防治流感最有效而安全的方式為接種疫苗［3］。傳統制備流感疫苗的方法是在雞胚中培養病毒，滅活純化后即得到經典的流感滅活疫苗，其主要抗原成分為流感病毒HA［4］。然而，該方法生產周期長，需要巨大的工作量，同時難以對抗甲型流感抗原的易突變性。因此，開展新型流感疫苗及其關鍵技術的研發仍然是流感研究的熱點。流感病毒基因工程疫苗是近年興起的一門新技術，是將流感病毒基因片段克隆入合適的表達載體，在體外表達病毒抗原后經純化制備而成的疫苗，常用的表達系統有大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞或桿狀病毒等。特別是在流感大流行期間，借助成熟的分子生物技術和生物發酵技術，即可在短時間內研制并生產出大量的流感疫苗以滿足大規模接種之需。目前，基于不同靶抗原的流感基因工程亞單位疫苗的有效性已經在多項研究中得以證實。

HA蛋白是流感病毒重要表面抗原，以HA為靶抗原的流感病毒基因工程疫苗是目前研究最多的基因工程疫苗。早在二十世紀七十年代，研究人員就證實流感病毒表面抗原HA能在試驗動物中誘導產生有效的特異性抗體。有研究人員使用中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary cell，CHO）細胞表達重組H7抗原，證實H7抗原能夠在小鼠中誘導高滴度的中和抗體，賦予小鼠抵抗活病毒攻擊的能力［5］。目前，利用大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞以及植物細胞表達系統表達HA（或HA1、HA2亞基）亞單位疫苗均有報道。例如，Flublok是由Protein Sciences公司所開發的一種三價季節性流感疫苗，是利用桿狀病毒昆蟲細胞表達系統分別表達H1N1、H3N2和B型3株病毒的HA，經純化后混合制備而成［6］。Flublok已經相繼在3 000多名志愿者人群中開展了4項臨床研究，結果顯示其在各年齡組人群中都具有良好的安全性，可誘導良好的免疫應答。Flublok于2013年1月獲得美國FDA批準用于流感的預防，是第一個獲得批準上市的重組亞單位疫苗［7］。植物來源的流感病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）也是近年來的研究熱點。D’Aoust等［8-9］將流感病毒HA基因通過農桿菌滲入法轉化本塞姆煙草后，在植物葉片中成功提取到了一種新型的含HA的VLP。動物試驗顯示，小鼠在給予1劑0.1 μg的VLP肌肉注射后即可產生相當高水平的免疫應答，2劑0.5 μg的VLP免疫后可保護小鼠免受來自相同亞型但不同分支的流感病毒致死量攻擊。至今，包括2009新甲型H1N1流感病毒在內的多種病毒的植物表達VLP均已成功制備，并在動物試驗中顯示了巨大潛能［10］。相關臨床研究表明VLP疫苗在人體的安全性、耐受性以及誘導的免疫應答水平均較好［11-12］。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）細胞表達系統是一種可以利用甲醇作為唯一碳源進行生長的營養型酵母，具有所需培養基成分簡單便宜、分子操作簡單方便、生長較快等優勢。自二十世紀八十年代以來，畢赤酵母表達系統逐漸被廣泛用于外源蛋白的表達生產。到目前為止，畢赤酵母已成為僅次于大腸桿菌的第二大表達系統，被廣泛用于外源蛋白的表達以及結構解析等方面。據RTC公司統計，至今畢赤酵母中成功表達出的蛋白多達5 000多個，且有1 500多個學術機構和工業實驗室將畢赤酵母表達系統用于科研和工業化生產，70多個畢赤酵母表達的商業化產品成功上市（http://www.pichia.com/）。畢赤酵母表達系統屬于真核表達系統，具有翻譯后修飾能力，因而可以快速制備具有糖基化結構的HA抗原，并且適合于在發酵罐中進行大規模生產，所以它是能應對流感暴發的理想表達系統［13］。根據最新文獻，已有研究團隊成功使用畢赤酵母系統來進行H1抗原的表達，研制了亞單位疫苗，并在小鼠中進行了免疫［14］。但是目前H3抗原的重組表達和疫苗研制還沒有研究團隊嘗試過。

密碼子優化是重組蛋白表達過程中常用的策略。在任一物種中，密碼子的使用頻率往往和編碼對應反密碼子的tRNA基因拷貝數、tRNA的表達量成正相關［15］。表達量較高的基因中多使用常見密碼子，這也被認為是自然選擇的結果，可以讓高度表達的基因更有效和精確地被翻譯。近年來不斷有研究顯示，密碼子偏好除了調控mRNA的翻譯速率，也通過共翻譯折疊影響著蛋白質的結構與功能［16-17］。密碼子頻率與蛋白質二級結構混亂度的負相關性也在粗糙脈孢菌、酵母、果蠅、小鼠等基因組中被發現，二級結構混亂度較高的區域總是傾向于使用稀有密碼子。這可能是一種降低翻譯速率給予更多時間可供折疊的機制，而對于這些區域過度的密碼子優化則有可能影響其正常的結構與蛋白質功能［18］。

因此，本研究首先參照畢赤酵母基因組對甲型流感病毒H3抗原進行科學的密碼子優化設計，目標是提高其在畢赤酵母系統中的蛋白質表達并維持正確的結構功能［19-20］；隨后，使用甲醇誘導型高效啟動子PAOX1分泌表達優化后的H3基因，構建高拷貝的畢赤酵母重組菌株；最后，通過金屬離子親和層析技術，對H3抗原進行純化分離，為下一步動物體內免疫打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：本研究所用酵母菌株均在GS115基礎上構建，大腸桿菌感受態細胞為DH5α菌株。質粒：本研究克隆H3基因使用pPICZα質粒，帶有AOX1啟動子、alpha因子分泌序列、組氨酸（6×his）標簽和博來霉素（Zeocin）抗性。試劑：質粒抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）；H3和引物序列合成由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；針對6×his標簽的一抗和二抗購自上海碧云天生物技術有限公司；純化用鈷柱購自ThermoFisher公司；無縫克隆試劑盒購自諾唯贊公司；其他化學品試劑購自華東理工大學材料平臺。

1.2 H3基因密碼子優化及序列合成

從NCBI網站獲得甲型流感病毒［A/New York/392/2004(H3N2)］H3抗原基因的原始序列（NC_007366），利用IUPRED在線工具（https://iupred2a.elte.hu/）對蛋白質進行二級結構混亂度分析。根據Codon Usage Database （http://www.kazusa.or.jp/codon/）獲得畢赤酵母基因組高表達基因中各密碼子的使用頻率ω，計算同義密碼子的相對使用頻率。基因的密碼子適應指數（codon adaptation index，CAI）曲線根據各密碼子的相對使用頻率數據繪制，滑動框采用15個密碼子。密碼子優化后序列交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 引物設計

根據引物設計原則利用SnapGene軟件設計引物，并將其交給蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物設計Tab. 1 Primer design

1.4 重組質粒的構建

將基因片段使用無縫克隆插入pPICZα質粒的alpha因子分泌序列之后，末端保留His和Myc標簽。構建好的質粒使用大腸桿菌擴增，測序驗證基因序列的正確性。

1.5 電擊轉化畢赤酵母及多拷貝的菌株篩選

構建好的質粒經BlnI酶切線性化后與新鮮制備的畢赤酵母感受態細胞混合，轉移到預冷的電擊杯進行電擊轉化。轉化結束后加入1 mL冰凍的1 mol/L山梨醇溶液和1 mL酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）復蘇2～3 h，離心，涂帶有高質量濃度Zeocin抗生素（0.7 mg/mL）的平板。

2～3 d后挑選出Zeocin抗性平板長出的單菌落，YPD培養-洗菌-緩沖復合甲醇培養基（buffered methanol-complex medium，BMMY）培養誘導H3表達，取上清進行組氨酸標簽的Western blot驗證，篩選目的基因表達量最高的轉化株。

1.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和蛋白質印跡法（Western blot）

將發酵液離心，取上清進行SDS-PAGE電泳，上樣量為20 μL。濃縮膠使用電壓80 V，分離膠使用電壓100 V。電泳恒壓100 V轉膜1.5 h，進行Western blot。一抗使用6×his單克隆抗體，二抗使用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗小鼠IgG抗體。

1.7 H3抗原的表達與純化

酵母菌株使用YPD培養基培養，當菌株懸液在600 nm波長處的光密度值為2～6時，將菌株用無菌水洗滌3次后轉移到BMMY（含1%甲醇）培養基誘導表達。每24 h補充1次甲醇，誘導72 h后離心收集上清。培養溫度為30℃。

純化H3抗原時，首先通過10 kD孔徑超濾膜包將發酵液上清濃縮10倍。在濃縮后的上清中加入等量的平衡緩沖液并調pH至7.4，加入鈷柱中與介質充分結合。分別使用含5 mmol/L和150 mmol/L咪唑的緩沖液進行洗滌和洗脫。將含目標蛋白H3的數管洗脫液合并，使用30 kD超濾管超濾去除雜帶、濃縮目標蛋白。將以上操作得到的樣品進行蛋白電泳檢測，經考馬斯亮藍染色和Western blot對表達和純化的效果進行表征。

1.8 紅細胞凝集試驗

血凝試驗于96孔V型微量反應板上進行。每孔分別加入50 μL不同濃度的H3蛋白樣品，陰性對照加入磷酸緩沖液（phosphote buffered saline，PBS），再依次加入1%雞紅細胞懸液50 μL，混勻后棄去50 μL。振板1 min后靜置，45～50 min后觀察結果。

2 結果與分析

2.1 密碼子優化

首先，我們從NCBI網站下載了H3抗原的原始基因序列，分析了其在畢赤酵母基因組中的CAI曲線（圖1，藍色曲線）和蛋白質的二級結構混亂度曲線（圖2），設計密碼子優化方案。總體原則是適當降低二級結構混亂度較高區域的密碼子優化程度，減少密碼子優化對蛋白質結構與功能的影響。二級結構混亂度小于0.5的區域替換為相對使用頻率最高的同義密碼子，二級結構混亂度大于0.5的區域替換為相對使用頻率次高的同義密碼子，得到優化后序列。將優化前后的堿基序列繪制 CAI 曲線進行比對，可以明顯看到CAI值的整體提高（圖1，紅色曲線）。

圖1 H3基因的CAI曲線Fig. l CAI curve of H3 gene

圖2 H3蛋白質二級結構紊亂度曲線Fig. 2 Protein secondary structural disorder curve of H3

2.2 表達載體的構建

我們將合成的H3基因片段亞克隆入pPICZα載體得到質粒pPICZα-H3（圖3）。

圖3 pPICZα-H3質粒圖譜Fig. 3 Plasmid map of pPICZα-H3

測序和酶切電泳結果表明重組質粒構建成功。如圖4所示，其中編號為2-4和1-4的菌株對應的泳道與理論上目的條帶的大小一致。將該質粒在AOX1啟動子內部線性化后電轉入畢赤酵母GS115菌株，篩選高表達轉基因菌株。

圖4 質粒構建的驗證結果圖Fig. 4 Verification of plasmid construction

2.3 H3抗原的表達與純化

重組質粒電轉化入畢赤酵母中后，通過增加Zeocin抗性質量濃度的方式篩選目標蛋白表達量最高的重組菌株。選取1.0～1.5 mg/mL Zeocin抗性平板上長出的重組菌落，經培養和甲醇誘導表達后，通過考馬斯亮藍染色和Western blot檢測目標蛋白，挑選表達量最高的菌株進行后續純化。如圖5所示，菌株1-3和菌株2-5具備相對較高的H3表達水平，因此選擇菌株1-3進行后續的表達純化步驟。

圖5 Western blot篩選H3高表達菌株Fig. 5 Screening for highly efficient H3 expressing strains by Western blot analysis

隨后，我們進行搖瓶培養和誘導重組菌，摸索了最優的培養條件（時間與濃度），獲得了含目標蛋白的上清，通過超濾濃縮、親和層析純化H3蛋白。使用考馬斯亮藍染色和Western blot檢測了純化結果。從洗脫組分來看，純化后蛋白中存在全長的H3蛋白，但也存在一定程度的降解組分（圖6和圖7，Lane 10）。經嘗試，通過控制超濾孔徑并多次超濾的方式可以有效地除去大多數降解條帶，保留較高純度的H3全長條帶（圖6和圖7，Lanes 11～14）。

圖6 H3蛋白純化考馬斯亮藍染色結果圖Fig. 6 H3 protein purification analyzed by coomassie brilliant blue staining

圖7 H3蛋白純化 Western blot結果圖Fig. 7 H3 protein purification by Western blot analysis

2.4 H3抗原的紅細胞凝集活性檢測

流感病毒表面的HA蛋白可與紅細胞表面唾液酸位點結合，導致紅細胞凝集，這也是血凝素名字的由來。因此，接下來我們檢測了通過重組表達與純化得到的H3抗原是否具有紅細胞凝集活性。紅細胞凝集試驗顯示，0.07～0.35 mg/mL的H3重組蛋白不具備血凝活性。當H3抗原位于流感病毒表面時，病毒顆粒作為承載核心起到相對富集的作用，而純化分離得到的H3抗原則分散溶解在溶液中，可能影響其血凝活性。因此，我們嘗試用結合H3抗原的鎳柱填料模擬病毒顆粒，并以空載鎳柱填料作為對照測試血凝活性。結果顯示，與PBS陰性對照相比，空鎳柱填料展示出一定程度的血凝活性，可能由填料本身的非特異性結合造成，而H3結合的鎳柱填料表現出相對更強的血凝活性。

3 討論

本研究選取常見流感病毒株的HA基因，在密碼子使用偏好分析和蛋白質混亂度分析的基礎上對其進行了密碼子優化，隨后采用優化序列進行了克隆表達及酵母轉基因菌株構建。在確認H3抗原在畢赤酵母系統中成功表達后，我們嘗試了蛋白純化分離技術。本研究采用新型的密碼子優化方法對H3基因進行優化，除了考慮密碼子使用頻率優勢，還考慮到蛋白的二級結構混亂度，希望避免過度優化導致蛋白失去原有的結構和功能的現象。從目前的純化結果來看，H3蛋白可以通過親和層析進行分離，表達過程中的降解條帶亦可以通過超濾有效去除。純化獲得的H3抗原溶液本身不表現出血凝活性，但是與鎳柱填料結合富集后表現出一定程度的血凝活性。

畢赤酵母表達系統能高效分泌蛋白，并且適合在發酵罐中高密度生長，大規模發酵［21-22］。有研究與我們的結果類似，顯示在畢赤酵母中重組表達獲得的H7抗原在溶液狀態也不表現出血凝活性，但是仍然具備在小鼠中誘導產生特異性抗體的功能［23］。另有研究顯示，畢赤酵母系統中1 L培養基可以純化出200 mg H5的HA胞外結構域蛋白，用該蛋白免疫雞可以保護其不受H5N1禽流感病毒的感染［24］。因此，本課題的后續研究有潛力實現H3抗原的大規模表達生產，助力疫苗研發。