叢枝菌根真菌侵染指標與植物促生效應相關性分析

李 俠 葉誠誠 張俊伶 李海港 王幼珊

(1.山西大同大學 生命科學學院，山西 大同 0370090；2.中國農業大學 資源與環境學院，北京 100193；3.溫州市優質農產品開發服務中心，浙江 溫州 325000；4.內蒙古農業大學 草原與資源環境學院/內蒙古自治區土壤質量與養分資源重點實驗室/草地資源教育部重點實驗室，呼和浩特 010018；5.北京市農林科學院 植物營養與資源研究所，北京 100097)

叢枝菌根的形成對植物營養元素(尤其是磷和鋅)的吸收具有促進或抑制作用[1]。這種相互作用的方向和程度受宿主植物和叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)種類的共同影響[2-4]。同一種AMF對不同宿主植物生長和養分吸收的效應不同。例如，Tran等[1]發現接種異形根孢囊霉Rhizophagusirregularis對15 種農作物(包括谷物、豆類和蔬菜)的效應不同，其中菌根對韭菜生長和礦質元素吸收的促進作用最大，而對三葉草卻表現抑制效應。不同AMF種類對同一宿主植物的生長效應也有差異。貧瘠土壤接種Funneliformismosseae后，小麥生物量及根系AMF侵染率等指標均高于接種R.fasciculatus和易誤巨孢囊霉Gigasporadecipiens[5]。

植物對AMF的功能響應差異可能與AMF的生存策略有關。根外菌絲在AMF吸收和運輸養分中非常重要，叢枝(Arbuscule)則是AMF與宿主植物細胞進行養分交換的場所[6]。關于不同AMF生長策略的研究表明，AMF的生長具有高度譜系保守性[7-8]。球囊霉科Glomeraceae具有較高的根系侵染率，因此可以減少病原菌，例如：尖孢鐮孢Fusariumoxysporum和腐霉Pythiumsp.對宿主植物根系的感染；巨孢囊霉科Gigasporaceae具有較高的根外菌絲密度，接種后增加了長葉車前植株地上部的磷含量；無梗囊霉科Acaulosporaceae的AMF根內侵染率和根外菌絲密度均較低[7]。因此，AMF生長特性不同導致其功能存在差異。此外，也有研究發現AMF生長在遺傳水平上具有高度變異，且AMF與宿主植物共生關系具有不對稱性，即AMF的生長難以用來預測宿主植物的生長[3,9]。目前已發現并報道的AMF形態分類大約有300 種。我國的AMF物種資源十分豐富且廣泛分布，發現并報道的AMF有147 種[10]，保存在我國“叢枝菌根真菌種質資源庫”的叢枝菌根真菌有40 種190 株，然而關于我國AMF不同菌種間生長特性的研究較少，缺乏對其功能的深入研究[11]。

傳統研究AMF的方法主要基于顯微觀察菌根侵染率[12]、菌絲密度[13]和孢子數[14]等。20世紀90年代以來，分子生物學技術被逐漸應用到AMF的研究中[15]。利用特異性較強的水解探針(TaqMan)可定量檢測根內和土壤中特定的AMF[16-19]。然而，定量PCR與顯微方法測定的結果不一，二者之間具有一定相關性[17,20-21]或者不相關[22-24]。菌根真菌對宿主植物基因(如營養代謝相關的基因等)表達也具有調控作用[25]。AMF專性誘導型磷轉運蛋白基因如玉米ZmPht1;6基因在玉米根系顯著上調[26]，但其與菌根侵染特征的關系還不清楚。因此，本研究擬以7 種AMF為研究對象，以玉米和紫花苜蓿作為宿主植物進行溫室盆栽試驗，測定菌根侵染率、根外菌絲密度、植物地上部生物量、磷/鋅吸收量、植物根系AMF gDNA豐度以及玉米根系ZmPht1;6的相對表達量。探究AMF生長特性及其與功能之間的關系，以期揭示菌根指標之間的關系及其對功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017-04-22—06-04在中國農業大學資源與環境學院溫室進行。供試土壤取自中國農業大學北京上莊試驗站長期定位試驗地，為砂壤土。土壤基本理化性質如下：有效磷4.18 mg/kg、硝態氮17.07 mg/kg、銨態氮2.83 mg/kg、速效鉀82.4 mg/kg、pH 8.19(m(水)∶m(土)=2.5∶1)、有機碳11.5 g/kg。風干土壤過2 mm篩后與河沙混合作為培養基質，m(土)∶m(河沙)=2.5∶1。用γ射線(25 KGray)對土壤基質進行滅菌。土壤基質中供應200 mg/kg氮((NH4)2SO4)，20 mg/kg磷(KH2PO4)，200 mg/kg鉀(K2SO4)作為底肥。同時按照氮供應量的1%加入硝化抑制劑(DMPP: 3,4-Dimethylpyrazole phosphate)。

供試玉米(ZeamaysL.)品種為鄭單958，紫花苜蓿(MedicagosativaL.)品種為中牧168。玉米種子在10% H2O2中浸泡 10 min(紫花苜蓿3 min)進行表面消毒，用蒸餾水洗滌數次后，在飽和CaSO4溶液中進行種子吸脹7 h(紫花苜蓿3 h)，而后將種子平鋪置于濕潤的濾紙上在黑暗中催芽用于播種。

供試菌種由北京市農林科學院叢枝菌根真菌種質資源庫(BGC)提供，選取7 種AMF：摩西斗管囊霉F.mosseae(HK01)、變形球囊霉Glomusversiforme(NM04B)、根內根孢囊霉R.intraradices(HEB07D)、幼套近明球囊霉Claroideoglomusetunicatum(XZ03B)、近明球囊霉C.claroideum(XJ06F)、細凹無梗囊霉Acaulosporascrobiculata(HK02A)、黏屑多樣孢囊霉Diversisporaspurca(SD03A)。每克菌劑的孢子數約為40～200個。

為了區分植物根系和AMF菌絲對宿主植物生長和功能的影響，本試驗采用分室的根箱裝置(圖1)，其中根室A的大小：長×寬×高分別為3 cm×8 cm×12 cm，菌絲室B的大小：長×寬×高分別為14 cm×8 cm×12 cm，高度在紫花苜蓿裝置中改為6 cm。A與B室之間用30 μm尼龍網隔開，該孔徑的網膜僅允許菌絲進入菌絲室。

A為根室，B為菌絲室。A is root compartment. B is hyphal compartment.圖1 試驗裝置示意圖Fig.1 Schematic of the experimental pots

1.2 試驗設計

試驗的2種植物分別設8個處理：在根室單獨接種7種AMF以及不接種對照CK，每個處理重復4次，完全隨機排列。

玉米根室A和菌絲室B分別加入400和1 840 g滅菌基質，紫花苜蓿為250和1 150 g滅菌基質。接種處理在根室土壤中間處分別鋪上32 g接種劑(玉米)和20 g(紫花苜蓿)接種劑(8%的接種量)，對照則接種等質量的滅菌接種劑和5 mL其他土壤微生物濾液。濾液由5 g接種劑加50 mL蒸餾水混勻后，用孔徑為20～25 μm、高壓滅菌的雙層濾紙過濾形成。根室A保留一株玉米，紫花苜蓿保留7株。生長44 d后收獲。

1.3 樣品采集與分析

收獲時，將植株地上部剪下清洗后裝入信封，105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干，稱重，磨碎。地上部磷和鋅含量用HNO3-H2O2微波消解儀(CEM, Matthew, NC, 美國)消解后，采用電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP-OES, OPTIMA 3300 DV, Perkins-Elmer, 美國)測定。菌根生長效應是通過植株地上部生物量計算得到[27]。計算公式如下：

菌根生長效應=ln(XAMF/Xnon-AMF)

式中：XAMF為接種AMF后植株地上部生物量，g；Xnon-AMF為不接種AMF的植株地上部平均生物量，g。菌根磷、鋅吸收效應計算方法同菌根生長效應。

1.4 菌根侵染率和菌絲密度測定

洗凈根系并用去離子水沖洗，用吸水紙吸干水分，取部分用于測定根系AMF侵染率，首先用10% KOH進行透明，之后用1% HCl酸化，再用0.05%曲利苯藍染色，然后從每個樣品中隨機抽取30根，置于載玻片上，置于100倍光鏡下采用交叉法觀察計算根系的叢枝侵染率(AC)、菌絲侵染率(HC)、泡囊侵染率(VC)和總AMF侵染率[12]。取菌絲室過2 mm篩的土壤5 g，采用濕篩抽濾法測定根外菌絲密度，每個樣品設3 個平行[13]。

1.5 根系AMF gDNA豐度測定

快速取部分上步驟洗凈的細根用錫箔紙包好裝入液氮中，帶回實驗室在-80 ℃冰箱中保存；并取部分根系鮮樣稱鮮重后在65 ℃下烘干，稱取干重后通過鮮重干重的比例計算根系的含水量。AMF根系gDNA豐度測定采用實時定量PCR法(探針法)測定。結合實驗室及菌種庫的條件，本試驗僅對F.mosseae,R.intraradices和C.claroideum3 種AMF的gDNA豐度進行測定。

定量PCR標準物制備：按照植物基因組DNA提取試劑盒(DN14，北京艾德萊生物科技有限公司)說明書提取植物根系總DNA，并用每種AMF的特異性引物進行普通PCR擴增，反應體系為25 μL：2.5 μL 10×PCR Buffer(含Mg2+)，2.0 μL dNTP，各0.3 μL的上下游引物(10 μmol/L)，0.3 μLTaq酶(全式金)，1 μL DNA模板和18.6 μL ddH2O。反應條件為：94 ℃預變性5 min，40個循環94 ℃變性30 s，X ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸5 min，引物序列和退火溫度見表1[19]。用PCR產物純化回收試劑盒(DR02，北京艾德萊生物科技有限公司)對普通PCR產物進行純化。純化后的PCR產物按照pMD19-T Vector (TaKaRa)試劑盒說明書的方法進行連接，用感受態細胞E.coilJM109(TaKaRa)進行轉化與克隆，將成功克隆的單菌落置于加有Amp/IPTG/X-Gal的LB液體培養基中過夜振蕩培養。過夜培養后的菌液分別用各自的AMF引物(表1)進行PCR擴增，挑選目的條帶明亮樣品送測序并返回質粒。用Nano drop測定質粒DNA濃度(ng/L)。每μL的拷貝數濃度(NC)計算公式如下：

式中：660為DNA的分子量，u/bp；K為 DNA濃度，ng/μL；L為真菌DNA目的片段長度和質粒片段長度之和(F.mosseae,R.intraradices,C.claroideum和質粒片段長度分別為122、250、177 和2 692 bp)；Na為阿伏伽德羅常數6.022×1023。

用ddH2O對質粒進行一系列稀釋，使獲得拷貝數范圍為102～109，用作標準曲線。

定量PCR：采用TaqMan探針法進行根系AMF gDNA豐度的絕對定量。將上述步驟提取的植物樣品DNA稀釋10倍作為模板，系列濃度稀釋后的質粒作為標準曲線，然后用每種AMF的特異性引物以及探針進行PCR定量，具體引物、探針序列及退火溫度見表1[19]。探針兩端修飾物分別為5′(FAM);3′(BHQ-1)，純化方法為PAGE(生工生物(上海)工程有限公司)。反應體系為25 μL: 2.5 μL 10×PCR Buffer(含Mg2+)，2.0 μL dNTP，各0.3 μL的上下游引物(10 μmol/L)，0.15 μL的水解探針(10 μmol/L)，0.3 μL Taq酶(全式金)和1 μL DNA模板，并加入18.45 μL ddH2O補足至25 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min，40 個循環94 ℃變性30 s，X ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，并在每次循環結束后收集熒光信號。每個樣品反應設置3 個平行，所有反應均在qTOWER 2.2儀器上完成，反應結束后輸入標準曲線的拷貝數濃度，通過qPCRsoft 3.0.29.0版本軟件計算出未知樣品的拷貝數濃度。將未知樣品的拷貝數換算成濃度(ng/μL)，根系AMF gDNA豐度的計算公式如下[19]：

表1 定量PCR的AMF引物、探針序列及退火溫度Table 1 Sequences of primers, hydrolysis probes and optimal annealing temperature used for the quantitative real-time PCR quantification of LSU gene copies of different AMF species

根系AMF gDNA豐度=

式中：根系AMF gDNA豐度，ng/mg；根系AMF gDNA濃度，ng/μL；根系干重，mg，EV為洗脫體積，μL。

1.6 ZmPht1;6相對表達量測定

采用實時定量PCR法測定，取用部分保存于-80 ℃ 冰箱的玉米根系，采用Trizol試劑(RNAiso Plus, Takara)進行植物總RNA提取，按照反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)的說明進行RNA反轉錄，使用 SYBR Premix EXTaqTM(Tli RNaseH Plus, Takara)試劑盒進行熒光定量PCR反應。反應體系為25 μL，反應體系如下：12.5 μL SYBR Green PCR mix，各0.5 μmol/L正向和反向引物，1 μL 稀釋10倍的cDNA模板以及10.5 μL ddH2O。反應程序為：95 ℃預變性2 min，40 個循環95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s。溶解曲線數據收集在反應結束后溫度從55 ℃升到95 ℃時，每L高0.5 ℃收集1 次熒光信號。每個樣品設3 個平行。PCR 反應中使用α-Tubulin4為內參基因，內參基因及目標基因引物序列引用參考文獻[28]。用2-ΔΔCt法計算相對表達量，計算公式如下[29]：

ΔCt=ΔCt對照-ΔCt內參
2-ΔΔCt=2-(ΔCt試驗-ΔCt平均)

式中：ΔCt對照為不接種對照處理目的基因的Ct值；ΔCt內參為內參基因的Ct值；ΔCt試驗為接種處理的Ct值；ΔCt平均為ΔCt值的平均值。

1.7 統計分析

所有數據采用Shapiro-Wilk檢測正態性、Levene’s檢測方差齊性。其中菌根侵染率、根系AMF gDNA豐度以及ZmPht1;6相對表達量的數據結果進行lg(x)轉化使其符合正態分布和方差齊性。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗不同接種處理對根外菌絲密度、菌根侵染率、菌根生長效應、菌根磷、鋅吸收效應、根系AMF gDNA豐度(紫花苜蓿)、ZmPht1;6相對表達量等指標的影響，方差分析顯著后，采用Duncan’s多重比較檢驗各菌種處理間差異的顯著性，采用單樣本t檢驗(One samplet-test)比較菌根生長效應、菌根磷、鋅吸收效應與零的差異。采用獨立樣本t檢驗(Independent samplet-test)比較玉米根系AMF gDNA豐度在2種菌種間的差異。相關分析采用Pearson法，回歸分析采用逐步回歸法。所有統計均用IBM SPSS Statistics 25.0分析，采用Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 玉米和紫花苜蓿根系AMF侵染率

接種F.mosseae、R.intraradices、G.versiforme以及C.etunicatum，對植株根系均有良好的侵染；而接種C.claroideum(僅玉米根系)、A.scrobiculata和D.spurca的玉米和紫花苜蓿根系幾乎無叢枝和泡囊的侵染。接種F.mosseae和R.intraradices的玉米和紫花苜蓿的根系AMF總侵染率顯著高于其他處理；接種G.versiforme、C.etunicatum次之，顯著高于接種C.claroideum、A.scrobiculata和D.spurca；根系菌絲侵染率、叢枝侵染率和泡囊侵染率在不同接種處理間的表現與根系總侵染率基本一致(表2)。

表2 玉米和紫花苜蓿根系AMF侵染率Table 2 AMF colonization rate in maize and alfalfa roots inoculated with different AMF species %

2.2 玉米和紫花苜蓿根外菌絲密度

測定菌絲室的根外菌絲密度發現(圖2)：接種F.mosseae玉米根外菌絲密度最高，顯著高于其他處理，接種R.intraradices次之，顯著高于G.versiforme；接種C.etunicatum與接種R.intraradices、G.versiforme無顯著差異；接種C.claroideum、A.scrobiculata、D.spurca玉米根外菌絲密度最低，顯著低于其他接種處理，且三者間差異不顯著(圖2(a))。接種F.mosseae、R.intraradices紫花苜蓿根外菌絲密度最高，顯著高于其他接種處理，接種G.versiforme次之，顯著高于接種D.spurca、A.scrobiculata，接種C.etunicatum、C.claroideum與接種G.versiforme、D.spurca、A.scrobiculata間差異不顯著(圖2(b))。

Fm， Funneliformis mosseae； Gv， Glomus versiforme； Rin， Rhizophagus intraradices； Ce， Claroideoglomus etunicatum； Cc， Claroideoglomus claroideum； Asc， Acaulospora scrobiculata； Dsp， Diversispora spurca。不同接種處理間差異采用Duncan’s多重比較進行分析，不同小寫字母表示不同接種處理間存在顯著差異(P<0.05)。下同。Significant differences among different inoculation treatments were tested by Duncan’s significant difference test (P<0.05). The same below.圖2 不同AMF接種處理下玉米(a)和紫花苜蓿(b)的根外菌絲密度Fig.2 Hyphal length density in the rhizosphere of maize (a) and alfalfa (b) plants inoculated with different AMF species

2.3 玉米和紫花苜蓿菌根生長效應

通過計算不同接種處理玉米和紫花苜蓿地上部的菌根生長效應后發現(圖3)：接種F.mosseae、G.versiforme、R.intraradices、C.etunicatum均顯著促進玉米和苜蓿地上部生長，且菌根生長效應顯著高于其他接種處理；接種C.claroideum、A.scrobiculata顯著抑制玉米地上部生長；接種C.claroideum卻顯著促進苜蓿地上部的生長；接種A.scrobiculata(僅苜蓿)、D.spurca對玉米和苜蓿地上部生長無顯著影響；接種A.scrobiculata、D.spurca玉米菌根生長效應顯著高于接種C.claroideum，而苜蓿菌根生長效應卻表現出相反趨勢。

*表示菌根效應大小與零的顯著性差異(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)。下同。* indicates that the effect is significantly different from zero (* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001). The same below.圖3 不同AMF接種處理下玉米(a)和紫花苜蓿(b)的菌根生長效應Fig.3 Mycorrhizal growth response of maize plants (a) and alfalfa plants (b) inoculated with different AMF species

2.4 不同接種處理下玉米和紫花苜蓿菌根磷和鋅吸收效應

通過計算不同接種處理玉米和紫花苜蓿地上部的菌根磷/鋅吸收效應后發現(圖4)：接種F.mosseae、G.versiforme、R.intraradices、C.etunicatum均顯著促進玉米和紫花苜蓿地上部磷、鋅的吸收，且菌根磷、鋅吸收效應顯著高于其他接種處理(圖4)；接種C.claroideum、A.scrobiculata(僅菌根磷吸收效應)顯著抑制玉米地上部磷、鋅的吸收；接種A.scrobiculata(僅菌根鋅吸收效應)和D.spurca對玉米地上部磷、鋅吸收均無顯著影響。接種A.scrobiculata、D.spurca玉米菌根磷(圖4(a))、鋅(圖4(c))吸收效應顯著高于接種C.claroideum；除C.claroideum顯著促進紫花苜蓿地上部磷吸收和A.scrobiculata顯著抑制紫花苜蓿地上部鋅吸收外，接種C.claroideum、A.scrobiculata和D.spurca對紫花苜蓿地上部磷、鋅吸收無顯著影響；紫花苜蓿菌根磷(圖4(b))、鋅(圖4(d))吸收效應表現為接種C.claroideum>接種D.spurca>接種A.scrobiculata。

圖4 不同AMF接種處理下玉米菌根磷(a)、鋅(c)吸收效應與紫花苜蓿菌根磷(b)、鋅(d)吸收效應Fig.4 Mycorrhizal phosphorus (a) and zinc (c) uptake response of maize shoot and mycorrhizal phosphorus (b) and zinc (d) uptake response of alfalfa shoot inoculated with different AMF species

2.5 玉米和紫花苜蓿根系AMF gDNA豐度及其與根系總侵染率的相關分析

接種F.mosseae玉米根系AMF gDNA豐度顯著高于接種R.intraradices，而接種C.claroideum玉米根系中未檢測到C.claroideumgDNA(圖5(a))；接種F.mosseae紫花苜蓿根系AMF gDNA豐度顯著高于接種R.intraradices，后者又顯著高于接種C.claroideum(圖5(b))。

紫花苜蓿根系AMF gDNA豐度的lg值與根系總侵染率(圖5(d))呈極顯著相關(r=0.83，P<0.001)。而玉米根系兩者不顯著(圖5(c))。

圖5 不同AMF接種處理玉米根系AMF gDNA豐度(a)及其與根系總侵染率的相關性(c)，紫花苜蓿根系AMF gDNA豐度(b)及其與根系總侵染率的相關性(d)Fig.5 Abundance of mycorrhizal gDNA inoculated with different AMF species (a) and its correlation analysis with total colonization rate (c) in maize root, and Abundance of mycorrhizal gDNA inoculated with different AMF species (b) and its correlation analysis with total colonization rate (d) in alfalfa roots

2.6 玉米根系ZmPht1;6相對表達量及其與菌根磷吸收效應的相關分析

不同AMF菌種顯著影響玉米根系ZmPht1;6基因的相對表達量。接種F.mosseae玉米根系ZmPht1;6的相對表達量遠高于其他接種處理，接種G.versiforme和C.etunicatum次之，顯著高于接種R.intraradices和D.spurca，后兩者玉米根系ZmPht1;6的相對表達量又顯著高于接種A.scrobiculata和C.claroideum(圖6(a))

玉米根系ZmPht1;6基因的相對表達量的lg值與地上部菌根磷吸收(圖6(b))呈極顯著相關(r=0.88，P<0.001)。

圖6 不同接種處理玉米根系ZmPht1;6基因的相對表達量(a)及其與菌根磷吸收效應的相關性(b)Fig.6 Relative expression of ZmPht1;6 inoculated with different AMF species in maize roots (a) and its correlation analysis with mycorrhizal P uptake response (b)

2.7 AMF生長與功能的相關分析和多元回歸分析

將植株根系AMF總侵染率和根外菌絲密度分別與菌根生長效應和磷、鋅吸收效應進行Pearson相關性分析，結果顯示玉米和紫花苜蓿根系AMF總侵染率及根外菌絲密度均與其菌根生長效應和磷、鋅吸收效應具有較高的正相關性，相關系數達0.58～0.90(表3)。

表3 AMF生長與植株菌根生長效應和磷、鋅吸收效應的相關性分析Table 3 Correlation analysis between AMF growth indices with mycorrhizal growth,>phosphorus and zinc uptake response of host plants

用根系菌絲侵染率、叢枝侵染率、泡囊侵染率、總侵染率及根外菌絲密度作為自變量，菌根生長效應和磷、鋅吸收效應分別作為因變量進行逐步回歸分析。結果發現，對玉米而言，僅根系AMF總侵染率進入回歸方程，回歸方程分別為：菌根生長效應=總侵染率×0.012-0.066；菌根磷吸收效應=總侵染率×0.017+0.009；菌根鋅吸收效應=總侵染率×0.016-0.007。在此模型中根系AMF總侵染率分別解釋了79.0%的玉米菌根生長效應變異、77.6% 的菌根磷吸收效應變異以及74.1%的菌根鋅吸收效應變異。對紫花苜蓿而言，僅根系AMF菌絲侵染率均進入回歸方程，回歸方程分別為：菌根生長效應=菌絲侵染率×0.03+0.413；菌根磷吸收效應=菌絲侵染率×0.038+0.651；菌根鋅吸收效應=總侵染率×0.033+0.102。在此模型中根系AMF菌絲侵染率分別解釋了76.5%的菌根生長效應變異、72.6%的菌根磷吸收效應變異以及74.0%的菌根鋅吸收效應變異。

3 討 論

AMF生長具有高度譜系保守性，并表現出一定程度的菌株特異性[8-9]。本試驗也得出了相似結果，球囊霉科表現出高度譜系保守性：接種F.mosseae、R.intraradices和G.versiforme的侵染率均較高；近明球囊霉科則表現出一定的菌株特異性：接種C.etunicatum的侵染率較高，但接種C.claroideum的侵染率較低，在玉米根系中幾乎無侵染(表2，圖2)。由于菌種庫菌種的限制，本試驗同一科僅比較了球囊霉科和近明球囊霉科科內菌種間的差異，對于其他科AMF的研究還需進一步探索。

AMF對植物的生長和營養吸收表現出正效應[30-31]、負效應[31-32]或無效應[1]。Meta分析發現AMF促進了谷物的產量[33]和鋅含量[34]，且其對植物磷的貢獻最高可達到90%[35]。本研究中發現接種F.mosseae、R.intraradices、G.versiforme、C.etunicatum對玉米和紫花苜蓿生長和磷、鋅吸收均表現為正的促進效應，A.scrobiculata、D.spurca對玉米和紫花苜蓿生長和磷、鋅吸收表現為無顯著影響或抑制作用，C.claroideum對紫花苜蓿生長和磷吸收為促進效應，而對玉米生長和磷、鋅吸收卻表現出抑制效應(圖3，圖4)。Wagg等[36]的研究結果也發現，接種C.claroideum提高了紅車軸草地上部生物量，卻抑制了多花黑麥草的生長，這可能是與植物根系形態特征有關[37]。本研究中植株的菌根生長效應、磷鋅吸收效應與菌根侵染率及根外菌絲密度均表現出顯著的正相關關系(表3)，且回歸分析發現菌絲侵染率或總侵染率能解釋植株菌根生長和磷、鋅吸收效應的72.6%～79.0%變異，表明AMF在根系的侵染指標(菌絲侵染率和總侵染率)是影響宿主植物地上部生物量和磷、鋅吸收量的主要因子。

本試驗中紫花苜蓿根系AMF gDNA豐度與根系總侵染率的趨勢具有較高的相關性(圖5(d))，該結果與已有研究結果類似[17, 20-21]。玉米根系F.mosseae的gDNA豐度顯著高于接種R.intraradices(圖5(a))，但在紫花苜蓿中則呈相反的趨勢(圖5(b))。然而，顯微觀察法測定的侵染率結果顯示，玉米和紫花苜蓿根系2 種AMF的總侵染率并未出現顯著差異(表2)。產生這些差異的原因可能是基于DNA的定量PCR測定方法比傳統顯微觀察法更靈敏。已有研究報道Funneliformismosseae、Rhizophagusintraradices、Claroideoglomusclaroideum、Gigasporamargarita、Scutellosporapellucida等5 種AMF的定量PCR方法測定gDNA豐度。結合當時實驗室及菌種庫的條件，本試驗僅對其中3 種菌種的gDNA進行測定，對于其他AMF菌種的測定還需進一步探索。

不同AMF誘導蒺藜苜蓿和番茄等植物中磷轉運蛋白的表達能力不同[38-39]。本試驗中接種F.mosseae玉米根系ZmPht1;6的相對表達量遠高于其他接種處理(圖6(a))，但接種F.mosseae玉米地上部菌根磷吸收效應顯著低于接種G.versiforme，且與接種R.intraradices差異不顯著(圖4(a))。可能原因是F.mosseae菌絲吸收磷的效率較低[40]。已有研究結果表明受AMF誘導的磷轉運蛋白ZmPht1;6表達能力與玉米地上部磷吸收量具有極顯著的正相關關系[41]，然而近期研究卻發現ZmPht1;6表達能力與磷吸收相關性不確定[42]。本試驗中接種球囊霉科AMF玉米根系ZmPht1;6基因的相對表達量與菌根磷吸收效應差異趨勢并不完全一致，但不同AMF對玉米地上部菌根磷吸收效應和ZmPht1;6基因相對表達量的影響趨勢基本一致，相關系數達0.88(圖6(b))。因此，在一定程度上，ZmPht1;6的相對表達能力可反映AMF的吸磷能力[43]。

4 結 論

AMF的生長特性(總侵染率和根外菌絲密度)與其功能(宿主植物地上部生物量、養分(磷和鋅)菌根吸收效應)之間均具有較高的正相關性；多元回歸分析表明根系AMF侵染率能夠較好地解釋植株地上部生長和菌根磷、鋅吸收效應的差異；實時定量PCR能很好地反映紫花苜蓿根系AMF侵染；玉米根系ZmPht1;6的相對表達量在一定程度上可以反映AMF的吸磷能力。由于本試驗采用的AMF種類有限，測定的功能也僅限于植物生長和養分吸收兩方面，今后仍需要進行大范圍菌種和多功能的驗證，為開發AMF資源提供科學依據。