基于轉錄組的莧菜LBD基因家族鑒定及藍光下的表達分析

王 樂 陳 何 肖 昉 鄭友峰 黃瑞丹 劉生財

(福建農林大學 園藝植物生物工程研究所，福州 350002)

側生器官邊界結構域(Lateral organ boundaries domain，LBD)是一種轉錄因子，在植物中以基因家族的形式特異性存在，又稱為ASL(Asymmetric leaves2-like)[1]。LBD基因家族在多種高等植物的生長發育和代謝調控等多個過程中發揮重要的調節作用，還參與愈傷組織形成的分子調控網絡機制[2]。LBD蛋白由一個典型的保守LOB(Lateral organ boundaries)結構域(也稱AS2結構域)和一個可變的C末端組成[3-4]。LOB結構域可分為三部分，一個是與DNA結合所必需的C結構域(C-domain)，由4個保守的半胱氨酸(C)殘基組成的CX2CX6CX3C(X是不保守的氨基酸殘基)基序；一個是影響與DNA結合活性的不變的Gly-Ala-Ser(GAS-block)區域，它的C端有1個脯氨酸(P)殘基；最后一個是參與了蛋白質二聚化的類亮氨酸拉鏈基序(Leucine-zipper-like motif)，是由4個賴氨酸和幾個X組成的LX6LX3LX6L螺旋卷曲結構[2,4-5]。根據保守結構域的不同，可將LBD基因家族分為兩大類：第一類(Class I)包含CX2CX6CX3C、GAS-block和LX6LX3LX6L基序，第二類(Class II)只含有CX2CX6CX3C基序。Class II的LBD基因都比較保守，不同基因間的相似度很高，且都無法形成卷曲螺旋結構[2]。

迄今為止，隨著多個物種全基因組和轉錄組測序的完成，LBD基因家族在多個物種得到鑒定。最初在擬南芥發現有43個LBD基因[6]，隨后在水稻[7]、馬鈴薯[8]、茶樹[9]、大麻[10]、葡萄[11]、辣椒[12]、煙草[13]、玉米[14]、蒺藜苜蓿[15]、番茄[16]和大麥[17]中分別鑒定出35、43、31、32、30、45、98、44、56、46和24個LBD基因。第一個被發現的LBD基因是擬南芥[6]中的AtLOB基因，這些研究結果為LBD家族成員的鑒定、研究蛋白生物信息學和探究基因功能提供了重要的理論支持。近期有研究表明，LBD不僅調節早期植物側生組織器官發育，也對植物再生、次生生長和環境信號的響應等有調節作用。擬南芥AtLOB(AtASL4)主要在側生組織的近端基部表達，調節幼葉的生長發育[6]。Li等[18]研究發現，水稻OsLBD37和OsLBD38通過下調抽穗期關鍵調控因子Ehd1的表達，影響了成花素基因Hd3a和RFT1的表達，從而導致水稻抽穗期延遲。在擬南芥中過表達AtLBD16、AtLBD17、AtLBD18和AtLBD29基因能夠顯著促進愈傷組織的形成[19]。王小非等[16]研究表明，番茄LBD基因響應鹽脅迫和干旱脅迫，在高溫和脫落酸作用下表達無顯著變化。Mangeon等[20]研究發現，擬南芥AtLBD25/DDA1下胚軸的生長受光調控，AtLBD25突變體的下胚軸在黑暗培養條件無法伸長。大豆GmLBD12受到干旱、鹽分、低溫、吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)和水楊酸(SA)的調控[21]。

隸屬于莧科莧屬的一年生草本植物莧菜(AmaranthustricolorL.)富含多種次生代謝產物，營養和藥用價值極高[22]。迄今為止，尚未在莧菜中見到LBD基因家族的報道。本研究依據莧菜轉錄組測序的數據庫，在轉錄組水平上對莧菜AtrLBD基因進行分析；構建莧菜與擬南芥的LBD蛋白系統進化樹；預測AtrLBD和miRNA之間的調控關系，以及AtrLBD與擬南芥同源蛋白互作關系；分析AtrLBD基因的表達模式，用qRT-PCR檢測AtrLBD在藍光和黑暗條件下的表達情況，旨在為進一步探究莧菜AtrLBD基因家族的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究試驗材料為福建農林大學園藝植物生物工程研究所提供的‘全紅’莧菜。在加入適量DDH2O的培養皿上播種‘全紅’莧菜種子，分別在黑暗(Dark)(25 ℃)和藍光(Blue)(25 ℃，2 400 lx)條件下培養36～40 h后取莧菜胚軸，每次取0.1 g，液氮研磨，重復取樣3次，放于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1AtrLBD基因家族成員鑒定

根據擬南芥LBD基因ID[4]，TAIR數據庫(https:∥www.arabidopsis.org)下載獲得的擬南芥LBD蛋白作為探針序列，利用BioEdit軟件，以研究前期測序獲得的藍光和黑暗處理‘全紅’莧菜胚軸的轉錄組數據庫進行本地blast，E值設置0.000 1，獲得第1組候選基因序列ID；通過轉錄組的NR、NT、Swiss-Prot和PFAM 4個數據庫注釋[23]，利用關鍵詞“LOB”進行檢索，獲得第2組候選基因序列ID。將2組數據結合比較，去除重復序列ID。通過TBtools軟件中的Fasta Tools將對應gene ID的AtrLBD基因序列提取出來，利用SMART在線軟件預測分析(https:∥smart.embl-heidelberg.de/)AtrLBD蛋白的保守結構域，去除不含有LBD家族特征結構域的序列；通過NCBI-blastp(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進一步比較，最終確定AtrLBD基因家族成員。將獲得的AtrLBD基因ORF序列在TAIR數據庫中blast，得到對應的模式植物擬南芥同源基因[12]。

1.2.2AtrLBD蛋白生物信息學及保守結構域分析

利用蛋白質基本性質分析工具(https:∥web.expasy.org/protparam/)對AtrLBD蛋白序列的分子量、等電點和不穩定系數等基本理化性質進行分析；通過在線軟件SOPMA(http:∥www.ibcp.fr/predict.html)對AtrLBD蛋白的二級結構(α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規卷曲)進行分析；利用在線軟件WoLF PSORT(https:∥wolfpsort.hgc.jp/)對AtrLBD蛋白進行亞細胞定位分析；通過軟件DNAMAN對AtrLBD蛋白進行保守結構域的序列比對分析；使用MEME在線軟件(http:∥meme-suite.org/tools/meme)分析AtrLBD的保守基序，將基序數目設置為10。

1.2.3AtrLBD與擬南芥LBD家族蛋白系統進化樹的構建

利用Clustal W對莧菜和擬南芥LBD蛋白序列進行多序列聯配比對計算分析。通過軟件MEGA 5.0，采用鄰接法(Neighbor-joining method，NJ)構建16個莧菜AtrLBD蛋白系統進化樹并與43個擬南芥LBD蛋白共同構建系統進化樹，校驗參數(Bootstrap method)設置為重復1 000次[24]。

1.2.4AtrLBD家族成員miRNA預測及在擬南芥中的同源蛋白互作關系

通過psRNATarget在線分析軟件(http:∥plantgrn.noble.org/psRNATarget/)，以16個AtrLBD基因的cDNA序列作為靶基因預測的候選序列，microRNA序列從莧菜small RNA數據庫中獲得，Expectation設置為5.0，預測可能參與調控AtrLBD的miRNA[25]。通過STRING(https:∥string-db.org)在線軟件，以擬南芥作為模式植物構建蛋白互作網絡，預測16個AtrLBD蛋白與擬南芥蛋白之間的互作關系。

1.2.5AtrLBD基因家族差異表達模式分析

根據藍光和黑暗處理莧菜胚軸的轉錄組數據庫中的FPKM值，采用Excel的log函數計算法，TBtools軟件對AtrLBD基因家族進行分層聚類分析，并繪制表達熱圖。

1.2.6藍光和黑暗條件下AtrLBD基因的qRT-PCR分析

采用天漠植物RNA提取試劑盒(Catalog No.TR224-50)提取莧菜RNA，并逆轉錄成cDNA。AtrLBD基因家族成員的熒光定量引物由DNAMAN軟件進行設計(見表1)，并以EF1α作為內參基因。利用羅氏Light Cycler 480實時熒光PCR儀，參照Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix試劑盒，熒光定量反應體系為20 μL，qRT-PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，59 ℃ 反應20 s，72 ℃延伸20 s，重復45個循環。每個處理樣品設置3個生物學重復，AtrLBD基因的相對表達量由2-ΔΔCt法計算得出，用Origin 2017軟件繪制表達趨勢圖。

表1 AtrLBD的qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences of AtrLBD

2 結果與分析

2.1 AtrLBD基因家族的鑒定及生物信息學分析

基于‘全紅’莧菜轉錄組數據庫，經過本地blast和轉錄組中NR、NT、Swiss-Prot和PFAM這4個數據庫的注釋，去除重復的ID號，初步篩選了20個LBD基因家族相關基因。通過保守結構域SMART和NCBI-blastp在線網站進一步比對分析，刪除不含有LBD家族特征結構域的序列，最終從‘全紅’莧菜轉錄組中鑒定得到16個AtrLBD基因，根據轉錄組編號順序將其命名為AtrLBD1～AtrLBD16(CL6309.Contig1_All～Unigene47451_All)，見表2。將獲得AtrLBD基因ORF序列在TAIR數據庫提交blast比對，獲得同源性最高的擬南芥LBD基因及名稱。AtrLBD6、AtrLBD8和AtrLBD15的擬南芥同源基因都是LBD11，而AtrLBD3和AtrLBD11的擬南芥同源基因都是LBD39，這一比對結果為探索莧菜AtrLBD基因功能研究提供了參考。

表2 AtrLBD基因家族信息Table 2 AtrLBD gene family information

對從轉錄組中篩選出的AtrLBD進行生物信息學分析，發現其編碼的氨基酸數目差異較大，最長的AtrLBD蛋白(AtrLBD5)有351個氨基酸殘基，最短的(AtrLBD16)有91個氨基酸殘基；它們所對應的相對分子質量范圍在9.396～38.250 ku；理論等電點范圍在5.35～9.20，脂肪系數在68.51～101.76范圍內(表3)。除了AtrLBD1、AtrLBD11和AtrLBD16外，所有的AtrLBD都為親水蛋白。其中AtrLBD4、AtrLBD6、AtrLBD7、AtrLBD8、AtrLBD11和 AtrLBD15的等電點小于7是酸性蛋白，其余則為堿性蛋白，占AtrLBD家族的62.5%，說明在堿性蛋白的亞細胞環境中發揮作用的AtrLBD占多數。根據不穩定系數顯示，16個AtrLBD蛋白不穩定系數均大于40屬于不穩定蛋白。

通過在線軟件SOPMA預測AtrLBD蛋白二級結構發現(表3)，AtrLBD蛋白的主要元件是α-螺旋和無規卷曲結構，AtrLBD4、AtrLBD5、AtrLBD6、AtrLBD8、AtrLBD9、AtrLBD12、AtrLBD13、AtrLBD14和AtrLBD16都是α-螺旋結構占比最大，AtrLBD1、AtrLBD2、AtrLBD3、AtrLBD7、AtrLBD10、AtrLBD11和AtrLBD15是無規卷曲占比最大，而AtrLBD4沒有β-轉角結構。對其進行亞細胞定位預測分析發現，AtrLBD1、AtrLBD2、AtrLBD3、AtrLBD5、AtrLBD7和AtrLBD12定位均在細胞核中，說明這些家族成員在細胞核中發揮調控作用；AtrLBD4、AtrLBD6、AtrLBD8、AtrLBD9、AtrLBD13、AtrLBD15和AtrLBD16定位在葉綠體中，AtrLBD10、AtrLBD11和AtrLBD14定位在線粒體中，這些家族成員可能參與葉綠體和線粒體的基因表達調控。

2.2 AtrLBD蛋白的保守結構域分析

利用DNAMAN軟件對16個AtrLBD蛋白進行多序列比對，MEME在線軟件分析其LOB結構域的保守基序。DNAMAN分析結果顯示(圖1)，除了AtrLBD16外，所有AtrLBD蛋白的C端都含有由15個氨基酸組成的保守CX2CX6CX3C基序和GAS-block，進一步說明AtrLBD家族序列保守性較高，在莧菜內可能行使相似的功能。GAS-block的C端含有1個保守的脯氨酸(P)，在LBD行使生物學功能時有著重要作用[26]。

圖1 AtrLBD蛋白保守結構域序列比對Fig.1 Sequence alignment of the conserved domain of AtrLBD proteins

為了解‘全紅’莧菜LBD之間的進化關系，對篩選出來的16個AtrLBD蛋白進行系統進化樹構建(圖2(a))。根據系統進化樹分析結果，16個AtrLBD蛋白可分為2大類Class Ⅰ和Class Ⅱ，分別包括11個和5個AtrLBD。16個AtrLBD形成5個旁系同源基因對，其中Class Ⅰ中的AtrLBD6/AtrLBD8和AtrLBD1/AtrLBD12，Class Ⅱ中的AtrLBD2/AtrLBD3的自展值為100。這表明他們的基因序列十分相似，這些AtrLBD家族成員之間可能存在功能冗余現象。Class Ⅰ中的AtrLBD都含有類亮氨酸拉鏈樣基序(LX6LX3LX6L)，該結構可能與轉錄因子間的二聚化相關。

圖中數字表示自展值。不同顏色方塊代表不同的保守氨基酸。5′→3′的刻度值代表蛋白長度。The number in the figure represents bootstrap value. Different colored blocks represent different conserved amino acids. The scale value of 5′→3′ represents the length of protein.圖2 AtrLBD家族進化樹(a)及保守基序分析(b)Fig.2 Evolution tree (a) and conserved amino acids (b) of AtrLBD family

MEME分析結果表明(圖2(b))，AtrLBD家族成員中含有10個保守基序，不同成員之間所包含的保守基序存在差異，這說明AtrLBD家族成員既有功能冗余，同時也存在功能特異性。其中除了AtrLBD16外，其余AtrLBD都含有motif 1和motif 2，motif 3存在于AtrLBD1、AtrLBD4、AtrLBD5、AtrLBD6、AtrLBD8、AtrLBD9、AtrLBD12、AtrLBD14、AtrLBD15和AtrLBD16中；motif 4存在AtrLBD2、AtrLBD3、AtrLBD7、AtrLBD10和AtrLBD11中；只有AtrLBD6、AtrLBD8和AtrLBD15含有motif 5和motif 8；motif 6和motif 9出現了3次；motif 7和motif 10只出現了2次。出現頻率較高的motif說明在AtrLBD中扮演重要角色，根據MEME分析結果和Pfam在線數據庫對10個基序進行注釋發現(圖3)，motif 2注釋到CX2CX6CX3C基序，motif 1注釋到GAS保守結構域，motif 3注釋到LX6LX3LX6L。同一亞類成員間具有相同的motif，推測與其相應的基因生物學功能相關，LBD蛋白的功能特性主要由N端保守結構域決定。

保守氨基酸在每個基序的位置。The position of the conserved amino acid in each motif.圖3 AtrLBD蛋白的保守氨基酸序列Fig.3 The conserved amino acid sequence of AtrLBD proteins

2.3 AtrLBD與擬南芥AtLBD蛋白的進化關系分析

為了進一步了解‘全紅’莧菜LBD基因家族與擬南芥的同源性，根據基因家族進化樹的聚類特征，探索LBD基因在‘全紅’莧菜和擬南芥中的進化親緣關系。本研究利用MEGA 5.0軟件對43個擬南芥和16個莧菜LBD蛋白序列構建系統進化樹，結果如圖4所示。根據系統進化樹結果，共分為Class Ⅰ和Class Ⅱ 2個大組。Class Ⅰ可細分為Class Ia、Class Ib、Class Ic、Class Id和Class Ie 5個亞類，其中Class Ia包含4個AtrLBD，分別是AtrLBD6、AtrLBD8、AtrLBD9和AtrLBD15；Class Ib包含AtrLBD1、AtrLBD4和AtrLBD12；Class Ic只包含1個AtrLBD13；Class Id包括AtrLBD5、AtrLBD14和AtrLBD16。Group Ⅱ可分為Ⅱa和Ⅱb 2個亞類，Group Ⅱa包括5個AtrLBD家族成員AtrLBD2、AtrLBD3、AtrLBD7、AtrLBD10和AtrLBD11，占AtrLBD家族31.2%。其中Class Ia(AtLBD4/AtrLBD9)、Class Ib(AtLBD12/AtrLBD4)和Class Id(AtLBD 21/AtrLBD14)3組直系同源基因對的自展值大于90。含有相同基序的AtrLBD蛋白劃分為同一組，推測處在相近分支的LBD基因行使相似的功能。

不同背景顏色代表不同分組。圖中數字表示自展值。Different background colors represent different groups. The numbers in the figure represent bootstrap value.圖4 LBD家族蛋白系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of LBD family proteins

2.4 AtrLBD家族成員的miRNA預測及蛋白互作分析

通過psRNATarget在線分析軟件，以16個AtrLBD基因cDNA序列作為靶基因預測的候選序列，microRNA序列從‘全紅’莧菜small RNA數據庫中獲得，預測可能參與調控AtrLBD的miRNA，結果顯示(表4)，AtrLBD基因家族中有4個成員受到 miRNA調控。AtrLBD1受到miR5658調控，AtrLBD5受到miR5658和miR408-3p_2調控，AtrLBD8和AtrLBD15都受到miR172的調控。蛋白質既可以與自身家族成員發生互作，還可以與其他蛋白發生互作。利用在線軟件STRING，預測AtrLBD家族成員在擬南芥中同源蛋白的互作關系。蛋白互作預測結果顯示(圖5)，AtrLBD家族成員可以與多種蛋白互作，其中LBD38(AtrLBD2)和LBD39(AtrLBD3)互作關系較強，可能與其有功能相關性。

表4 AtrLBD基因家族的miRNA預測Table 4 MiRNA prediction in the AtrLBD gene family

圓圈表示蛋白，圓圈節點之間的直線表示蛋白之間的相互作用關系。不同顏色對應不同的相互作用類型。The circles represent proteins, and the lines between the circle nodes represent the interactions between the proteins. Different colors correspond to different interaction types.圖5 AtrLBD蛋白互作預測Fig.5 Prediction of AtrLBD proteins interaction

2.5 AtrLBD基因表達模式分析

為了進一步研究AtrLBD基因功能及特性，通過TBtools軟件對轉錄組的FPKM值進行log函數計算并繪圖，對AtrLBD基因家族的表達差異進行分析。聚類熱圖中用紅、黑和綠3種顏色代表基因表達強度，從紅到綠信號逐漸變弱。結果顯示(圖6)，16個AtrLBD基因在藍光和黑暗條件下展現出不同的表達水平，大部分AtrLBD基因對光的響應度不高，黑暗和藍光處理下表達量無顯著變化，只有少量基因表達差異。其中AtrLBD2、AtrLBD3、AtrLBD5和AtrLBD7在藍光和黑暗條件下均有較高的表達量。藍光條件下，AtrLBD5和AtrLBD10均表現為下調，而其他AtrLBD都是上調表達，說明雖屬于同一家族各AtrLBD基因功能也不相同。

從紅到綠表示信號逐漸變弱。Red to green indicates a gradual weakening of the signal.圖6 AtrLBD基因家族在藍光和黑暗下的特異表達分析Fig.6 Analysis of the specific expression of the AtrLBD gene family under blue light and dark condition

對16個AtrLBD基因做qRT-PCR分析(圖7)，將轉錄組數據庫中FPKM均值與qRT-PCR結果相比較，除了AtrLBD4和AtrLBD16，其余14個AtrLBD基因在黑暗和藍光處理下胚軸中的相對表達量趨勢與轉錄組中FPKM值趨勢相符，這也說明轉錄組數據的可信度。

*表示不同處理之間差異顯著(P<0.05)。* indicates significant difference in different treatment (P<0.05).圖7 16個AtrLBD的qRT-PCR結果與轉錄組對應FRKM值Fig.7 qRT-PCR results of 16 AtrLBD and corresponding FRKM in transcriptome

3 討論與結論

LBD轉錄因子在植物中特異性存在，對植物生長發育及響應脅迫方面起著至關重要作用。LBD基因家族成員的數目在不同物種之間有很大的差異，在煙草[13]中鑒定出有98個LBD基因，而在大麥[17]中只鑒定出24個LBD基因。迄今關于莧菜LBD基因家族鑒定及其功能分析研究尚未見報道。本研究基于‘全紅’莧菜轉錄組數據庫，利用生物信息學分析技術，從‘全紅’莧菜中共鑒定出16個AtrLBD基因，分為Class Ⅰ和Class Ⅱ 2組，與大麥[17]、葡萄[11]和茶樹[9]中LBD基因家族成員數目相近。AtrLBD蛋白的主要元件是α-螺旋和無規卷曲結構，在細胞核、葉綠體和線粒體中均有所表達，這與葡萄LBD基因的研究結果相似[11]。進化關系分析發現，莧菜LBD基因家族有5個旁系同源基因對，說明LBD基因在漫長的進化過程中出現了基因復制現象。

模式植物擬南芥是雙子葉植物中研究最深入的，基因功能也廣泛在其他物種得到了驗證。基因功能驗證表明，Class Ⅰ類主要參與生長發育調控，Class Ⅱ類可能參與了環境脅迫響應[4,27]。對擬南芥和莧菜LBD蛋白的系統進化分析發現，LBD在進化過程中比較保守，聚在同一大類或亞類的基因可能具有相似功能，聚類關系越緊密可能性越大。研究發現，擬南芥AtLBD21(AtASL5)參與了擬南芥分生組織的發育[28]，同源AtrLBD14可能調控莧菜分生組織形成；AtLBD6(AtAS2)能抑制近軸區域的細胞增值分化，使葉片形成對稱平展葉，而且還同AtLBD5參與了花的發育過程[5]，推測與其處在同一分支的AtrLBD5和AtrLBD16也具有相似功能；擬南芥AtLBD37、AtLBD38和AtLBD39能夠調控花青苷的合成和氮素代謝[29]，推測與此對應的莧菜同源基因AtrLBD2、AtrLBD3和AtrLBD11同樣影響莧菜的次生代謝；AtLBD40參與植物GAs的響應[30]，與其處在同一分支的AtrLBD7也可能響應赤霉素。有研究表明，AtARF7和AtARF19通過上調AtLBD16、AtLBD18和AtLBD29表達從而調控側根發育[31-33]，這3個基因聚集在Class Ic中，與此同處在Ic中的莧菜AtrLBD13可能同樣受到生長素誘導表達。而AtLBD4/AtrLBD9和AtLBD12/AtrLBD4這兩組同源基因的功能還有待研究驗證。

MicroRNA參與調控植物生長發育過程，是參與轉錄后調控的關鍵因子[34]。在LBD基因家族分析中鮮見miRNA靶向預測分析。本研究利用在線軟件預測的結果表明AtrLBD1受到miR5658靶向調控，AtrLBD5受到miR5658和miR408靶向調控，AtrLBD8和AtrLBD15受到miR172靶向調控。在擬南芥中miR408的過表達會顯著提高花青素的含量[35]。推測miR408通過翻譯抑制AtrLBD5的表達，協同miR5658參與莧菜次生代謝過程，這有待進一步研究驗證。擬南芥隱花色素基因CRY1和CRY2受到藍光刺激后以不依賴于CONSTANS(CO)的方式，調節miR172的表達，從而調節光周期開花時間[36]。已有大量研究表明，植物miR172在調控植物成花方面起重要作用[37]。miR172可能通過裂解AtrLBD8和AtrLBD15的轉錄水平，進而參與莧菜成花調控。擬南芥同源蛋白互作預測結果顯示，LBD38(AtrLBD2)和LBD39(AtrLBD3)互作關系較強，可能存在功能相關性。

藍光可以影響植物體內生長素代謝途徑，從而調控植物的生長發育[38-40]。LBD作為生長素調節因子ARF的下游靶基因，與ARF共同調控植物生長發育。qRT-PCR研究結果表明，16個AtrLBD基因在黑暗和藍光下表現出不同的表達水平，大部分AtrLBD響應藍光誘導且差異顯著。16個AtrLBD基因中只有AtrLBD4、AtrLBD5、AtrLBD10和AtrLBD16受到藍光負調控。而AtrARF基因家族中有7個成員在藍光下表達上調，13個成員表達下調[41]。且在藍光處理下的莧菜幼苗胚軸變短，生長受到抑制[41-42]。推測在藍光下莧菜AtrARF與AtrLBD相互作用，影響植物體內生長素代謝途徑，從而調控植物的生長發育。

Simonini等[43]研究表明ARF的活性受生長素調控。AtrARF2在高濃度2,4-D處理下表達量顯著上調;AtrARF9在低濃度2,4-D處理下就開始響應表達量上調，在高濃度2,4-D處理下反受到抑制，且在2,4-D處理下莧菜幼苗生長和甜菜色素積累受到抑制[44]。AtrARF2和AtrARF9是否與AtrLBD進行相互作用，從而調控莧菜生長發育和甜菜色素積累的分子機理并不清楚，還需要深入研究。

轉錄組學是研究細胞表型和功能的一個重要手段，轉錄組水平的調控是最重要也是目前最廣泛的生物體調控方式。本研究從轉錄組中篩選出16個莧菜AtrLBD基因，進行序列特征、蛋白理化性質、保守基序和系統進化分析，利用轉錄組數據分析了AtrLBD在黑暗和藍光下的表達模式，預測了可能參與莧菜次生代謝產物合成的部分AtrLBD基因，而這些基因功能還待進一步進行驗證。本研究為闡明AtrLBD基因家族調控莧菜的生長發育奠定了基礎。