陸地棉小GTP結合蛋白基因GhROP3的克隆、表達及VIGS載體的構建

胡子曜 代培紅 劉超 瑪迪娜·木拉提 王倩 吾尕力汗·阿不都維力趙燚 孫玲 徐詩佳 李月

（新疆農業大學 農業生物技術重點實驗室，烏魯木齊 830052）

棉花是我國重要的經濟作物，種植廣泛。然而棉花在生長過程中會受到一系列的生物脅迫和環境因素的影響。這些不利因素會影響棉花的生長、產量以及纖維品質，繼而造成巨大的經濟損失。因此，發掘棉花抗逆相關基因并研究其抗逆的分子機制，培育棉花抗逆新品種進而獲得高產高品質的棉花，對于提高棉花產量和農民收入，促進經濟發展具有重大意義。

小G蛋白（small GTPases）家族成員是一類分子量為20-30 kD的單體蛋白，廣泛存在于真核生物中［1］，通過其獨特的調節方式，在植物細胞信號轉導及生長發育等生理活動中起關鍵的作用［2］。根據其結構和功能的不同，將其分為Ras、Ran、Rab、Rho和Arf等5個家族［3］，在真核生物中，Ran、Rab、Arf家族蛋白的功能主要參與囊泡和大分子運動的調節，而Ras和Rho家族蛋白則是信號轉導開關。ROP蛋白是一類植物特有的Rho類小G蛋白［4-5］，具有GTP酶活性，通過與GTP結合和水解過程中構象的變化促進了ROP蛋白與效應因子或調節蛋白的短暫相互作用，從而導致信號級聯的周期性激活或失活，在植物信號傳導途徑中起分子開關的作用［6］，ROP家族蛋白作為植物特有的上游信號傳遞的分子開關，參與了植物對病原菌的防衛調控及抗逆反應。

最早在豌豆中發現了第一個ROP基因，目前，已在沉香、番茄、辣椒、煙草、玉米、棉花、水稻、擬南芥、苜蓿、葡萄、大豆等多種作物中克隆了ROP基因，對ROP基因的功能研究也更加深入，研究發現該類基因除了參與細胞分裂、根毛極性生長、花粉管生長、激素反應等生理活動外［7］，也響應了高溫、鹽、低溫、干旱脅迫和抗病反應［8］。目前，對于棉花中ROP家族基因的研究報道主要集中在棉花纖維發育和陸地棉對黃萎病菌的抗病反應，對其在非生物脅迫下的功能研究也有初步報道。雖然已有研究表明ROP基因響應棉花抗逆反應，但其對逆境的調控方式及抗逆分子機制還不清楚，仍需要進一步探究。李先碧等［9］從陸地棉克隆了GhRacA和GhRacB，這兩個基因在棉花纖維起始和伸長時期優勢表達。因此，推測其可能調控棉花纖維的早期發育；Delmer等［10］克隆了2個在棉纖維發育過程中初生和次生壁合成過渡時期的優勢表達的基因GhRac9和GhRac13，推測它們可能調控棉花次生壁的合成；王鈺靜［11］通過病毒誘導的基因沉默技術抑制棉花GhROP6的表達，沉默植株的抗病性顯著低于對照組，推測GhROP6正調控棉花對黃萎病的抗性；李月等［12］從陸地棉克隆了GhROP4并利用qRT-PCR技術分析了不同脅迫下該基因的表達情況，表明GhROP4響應非生物脅迫應答；但目前對于GhROP3的生物學功能研究還未見相關報道。

病毒誘導基因沉默（virusinduced gene silencing，VIGS）是近年來發展起來的一種快速、高效、高通量的反向遺傳學技術，其原理是利用重組病毒抑制植物內源基因的表達，通過表型或生理指標變化鑒定基因的功能，屬于轉錄后基因沉默［13］。

本研究利用同源克隆的方法從棉花cDNA中克隆得到的GhROP3，通過熒光定量PCR的方法分析該基因的組織表達特異性和不同逆境誘導條件下的表達模式，同時構建了該基因的VIGS沉默載體并通過農桿菌介導侵染棉花獲得沉默植株，旨為進一步驗證棉花GhROP3的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為陸地棉新陸早22，由新疆農業大學農學院農業生物技術重點實驗室提供。農桿菌菌株GV3101為新疆農業大學農學院農業生物技術重點實驗室保存；大麗輪枝菌強致病力落葉型菌株V991（Verticillium dahlia Kleb）、TRV病 毒 載 體 及含陽性對照TRV：GhCLA1載體的農桿菌菌株由新疆農業科學院核技術生物技術研究所黃全生研究員惠贈。XbaⅠ和SmaⅠ等限制性內切酶購于賽默飛（Thermo）公司，Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購于杭州博日科技公司，Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、RNase A、高保真聚合酶TransStar KD Plus、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和DNA分子量Marker均購自北京全式金生物技術有限公司。卡那霉素、慶大霉素、MES、乙酰丁香酮、MgCl2及培養基配制等化學試劑均為國產分析純。PCR所用引物的合成及DNA的測序均由上海杰李生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 棉花種植及脅迫處理 選取經硫酸脫絨后顆粒飽滿大小一致的種子，經30%的H2O2處理后，再用清水沖洗3-5遍，將種子浸泡于清水中直至露白，然后把種子平鋪在發芽紙上裝入自封袋中置于28℃恒溫培養箱中暗培養12 h，待胚根長至2-3 cm時，種植于蛭石∶黑土=1∶2的營養土中，25℃培養室、光照周期為16 h光照/8 h黑暗條件下培養并適時澆水，待棉苗生長15 d后用于脅迫處理。

選取生長一致的棉花，置于吸水紙上吸干水分，分別進行4℃低溫、干旱、高鹽（200 mol/L NaCl）脅迫處理，具體處理方法參照王娜等［14］已報道的方法進行。分別于脅迫處理后的0、1、3、6和12 h采集葉片，鹽脅迫處理的最適濃度及各取樣時間段的選擇參照李月等［12］的方法，同時對未處理材料的根、真葉、子葉、下胚軸和莖進行取樣，用于組織特異性表達檢測。不同的時間點及不同部位均取3個生物學重復。將所取材料液氮冷凍并-80℃保存，用于總RNA提取及目的基因表達分析。

待棉花第二片真葉完全展開時，參照王鈺靜［11］和李秀青等［15］的方法挑選生長狀況一致的棉苗進行接菌處理，在接菌0、6、12、24和48 h后取棉花幼根，不同的時間點均取3個生物學重復。取樣時用無菌水將根部清洗干凈，迅速液氮冷凍并-80℃保存，用于總RNA提取及目的基因的表達分析。

1.2.2 棉花總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 將上述樣品研磨成白色粉末，使用Biospin Plant Total RNA Extraction Kit試劑盒提取棉花不同處理、不同時間點和棉花不同組織的RNA，用Thermo Scientific（NanoDrop 1000）核酸分析儀和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的質量和完整性，質量檢測合格的RNA使用反轉錄試劑盒，進行cDNA第一鏈的合成。

1.2.3 棉花GhROP3的克隆及序列分析 從擬南芥TAIR網站（http：/www.arabidopsis.org/index.jsp）下載AtROP1（AT2G17800）基因的序列，在棉花EST數據庫（http：//www.leonxie.com）、棉花基因組數據庫（http：//www.phytozome.net）中進行比對，獲得棉花ROP基因的cDNA序列，將其命名為GhROP3。然后根據此序列的ORF（open reading frame）序列設計擴增引物（表1），以陸地棉新陸早22的cDNA為模板，使用高保真聚合酶TransStar KD Plus進行PCR擴增。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的條帶，并連接pEASY-Blunt-Zero克隆載體，轉化大腸桿菌Trans-T1感受態細胞。挑取單克隆進行質粒酶切鑒定，正確的陽性克隆質粒送上海杰李生物技術有限公司進行測序。試驗所用的PCR程序、擴增產物檢測及目的片段的純化回收均參照王娜等［14］方法進行。

用基因文庫（GenBank）為GhROP3申請登錄號，利用（http：//web.expasy.org/protparam/）在線程序計算GhROP3編碼蛋白質的理化參數。用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）在 線 程 序對該蛋白質進行信號肽預測分析。利用在線軟件TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測跨膜結構域。

1.2.4 目的基因的表達特征分析 以反轉錄的cDNA為模板，以棉花管家基因UBQ7［16］為內參基因，進行熒光定量PCR反應，反應體系和反應條件參照王娜等［14］方法，每個樣本進行3個技術重復。反應結束后根據目的基因和內參基因Ct值，使用2-ΔΔCt方法［17］計算目的基因的表達量。目的基因和內參基因熒光定量引物見表1。

1.2.5 陸地棉GhROP3的VIGS片段克隆與VIGS載體構建 根據GhROP3的CDS（591 bp）序列，利用SGN-VIGS在線軟件設計抑制目的基因表達的靶序列（291 bp），設計合適引物，并在其上、下游5'端分別加入XbaⅠ和SmaⅠ的酶切位點（表1），以cDNA為模板，PCR擴增目標片段。回收、檢驗、測序方法同1.2.1。將測序完全正確的質粒和VIGS沉默載體TRV2用XbaⅠ和SmaⅠ進行雙酶切并回收，將回收的目的條帶與TRV2載體用T4連接酶連接，轉化大腸桿菌Trans-T1感受態細胞，用XbaⅠ和SmaⅠ進行雙酶切鑒定，酶切正確的質粒取15 μL使用凍融法轉化農桿菌GV3101感受態細胞，28℃倒置培養2-3 d，用于后續試驗。1.2.6 農桿菌介導的VIGS侵染棉花及沉默效率檢測 參照李秀青等［15］的方法，挑取構建好的載體TRV:RNA1、TRV:RNA2、TRV:GhCLA1和TRV:GhROP3轉化農桿菌后，進行轉化棉花前的活化及重懸。待棉花幼苗生長至子葉完全展開且真葉還未露出時，參照王鈺靜［11］的方法選取生長較為一致的幼苗，利用注射法侵染棉花。將包含TRV:GhROP3和TRV:RNA1、TRV:GhCLA1和TRV:RNA1、TRV:RNA2和TRV:RNA1的重懸菌液侵染的棉花植株分別作為試驗組及陽性、陰性對照。

侵染棉株幼苗大約15 d時，當陽性對照TRV:GhCLA1出現葉綠素缺失的白化表型時，拍照記錄。對陰、陽對照和試驗組植株第二片真葉及根部進行取樣，每個樣本取3個技術重復。將所取樣本進行RNA提取并反轉成cDNA，利用熒光定量PCR反應檢測基因沉默效率。目的基因沉默檢測和陽性對照GhCLA1沉默檢測的熒光定量引物見表1。

表1 引物及用途Table 1 Primer and application

2 結果

2.1 GhROP3的克隆與序列分析

以陸地棉新陸早22的葉片cDNA為模板進行PCR擴增（圖1），擴增片段大小符合預期，表明已克隆出GhROP3的CDS序列并在基因文庫（GenBank）為其申請登錄號：MK955930。利用在線軟件對GhROP3進行生物學分析（表2），GhROP3的ORF為591 bp，編碼196個氨基酸，相對分子質量為21.75 kD，理論等電點為9.45，平均疏水性為負值，表明該基因編碼的蛋白為堿性、親水性蛋白；蛋白質信號肽預測結果顯示GhROP3蛋白無信號肽；亞細胞定位預測結果顯示GhROP3蛋白定位于細胞膜；跨膜結構域預測結果顯示GhROP3蛋白是非跨膜蛋白。

表2 棉花GhROP3的生物信息學分析Table 2 Bioinformatics analysis of GhROP3 in cotton

圖1 GhROP3的克隆Fig. 1 Cloning of GhROP3 gene

2.2 GhROP3的表達特征分析

利用熒光定量PCR檢測GhROP3在高鹽（200 mol/L NaCl）、干旱、低溫和黃萎病菌逆境脅迫處理下的表達模式，結果表明，GhROP3對以上處理均有應答反應，但在不同脅迫處理下基因表達模式不同。在高鹽處理下，GhROP3在1 h的表達量最高，在0和3 h基因表達量一致，無明顯差異，均顯著與高于6和12 h（圖2-A）。在干旱處理下，GhROP3在6 h的表達量均高于其他時間點，在0和12 h的表達量基本一致，均低于1和3 h（圖2-B）。低溫處理后，GhROP3在12 h的表達量高于其他時間點，但在其他時間點也有一定的表達量（圖2-C）。黃萎病菌侵染棉花后，GhROP3的表達量呈現先升高后降低的趨勢，在4 h的表達量最高，在24和48 h的表達量基本一致，在0 h的表達量最低（圖2-D）。GhROP3在不同組織中的表達分析結果表明，GhROP3在莖中的表達量最高，在根、葉、子葉和下胚軸中的表達量均處于低表達量水平（圖2-E），說明該基因的表達存在一定的組織特異性。

圖2 GhROP3的表達譜分析Fig. 2 Expression pattern analysis of GhROP3

2.3 GhROP3的VIGS載體構建

利用PCR方法擴增GhROP3的VIGS靶序列，所得產物大小符合預期（圖3-A）。將產物進行克隆并測序，所得結果與目標片段序列一致。經XbaⅠ和SmaⅠ酶切陽性質粒與VIGS沉默載體TRV2連接，并進行雙酶切鑒定（圖3-B），發現呈現2條條帶，一條大于8 000 bp的載體條帶和大小為250-500 bp的目標條帶，表明GhROP3的VIGS沉默載體構建成功。

圖3 GhROP3的VIGS載體的構建Fig. 3 Construction of VIGS vector of GhROP3

2.4 VIGS技術體系檢驗

將3個轉化體TRV∶GhCLA1、TRV∶GhROP3和TRV∶RNA2分別與TRV∶RNA1混合，分別侵染棉花子葉。侵染15 d后，表型觀察，陽性對照的葉片出現白化現象（圖4-A）；利用qRT-PCR技術檢測陽性對照GhCLA1和GhROP3在根和真葉中的表達量，結果顯示，目的基因的表達量均顯著性低于對照組（圖4-B-C），證明VIGS沉默載體在植株體內能夠正常工作，成功獲得GhROP3的沉默植株。

圖4 VIGS技術體系驗證Fig. 4 Verification of VIGS system

3 討論

棉花是我國重要的農業經濟作物，在國民經濟中占有舉足輕重的地位。而新疆由于其獨特的光熱資源，現已成為我國最大的棉花種植區［18］。但新疆棉花的大面積種植在推動地區經濟發展的同時，也給棉花黃萎病的爆發和流行提供了便利條件，黃萎病現已成為棉花生產的主要障礙，同時也是制約棉花高產、穩產、優產的關鍵因素；此外棉花在生長過程中還會遭受到一系列的非生物逆境脅迫，由于地理位置及氣候的影響，干旱脅迫同樣嚴重影響著新疆棉花的擴大生產，使得新疆地區棉花的生產優勢無法充分發揮出來。傳統的雜交育種方法難度大、周期長，已不能滿足現實生產發展的需求。因此，篩選、鑒定棉花抗逆相關基因，對保障棉花的有效供給具有重要的現實意義。

在黃萎病抗性基因篩選方面，Kawchuk等［19］在番茄中克隆出了Ve1、Ve2兩個抗黃萎病相關連鎖基因；陳捷胤［20］在海島棉中克隆出GbaVd1和GbaVd2，通過過表達GbaVd1和GbaVd2增強了擬南芥對黃萎病的抗性；Zhang等［21］沉默了海島棉中GbVe1后，沉默植株對黃萎病菌的抗性顯著降低，證明該基因在抗黃萎病反應中起正調控作用；此外，一些抗性相關基因如GhDIR1、GhROP6［11］、GhWRKY40-like、GhWRKY70［22］等也被證實參與棉花對黃萎病菌的抗性。同時近年來也研究發現了許多有利用價值的抗旱基因，例如AREB、NAC、DREB、ABH1、SAD1、NF-Y和WRKY等轉錄調控基因；SnRK2、ERA1、MAPK、GGB［23］、DST［24］等蛋白翻譯后修飾調控基因；CDPK、LOS、NCED和PLC等新陳代謝調控基因；LEA、P5CS、TPS、和betA等滲透保護調控基因［25］。

ROP蛋白作為傳遞細胞內和細胞外刺激信號的分子開關，調節細胞內的各種反應［7］。在擬南芥中，AtROP11的表達影響種子萌發、幼苗生長、氣孔關閉、脫落酸介導的反應和干旱脅迫反應［26］；AtROP1是ABA調控氣孔開閉中的一個重要基因，該基因在氣孔保衛細胞中優勢表達，ABA通過滅活AtROP1蛋白，誘導氣孔開閉［27］；擬南芥ROP效應子RIC1的敲除通過改善解聚微管的重組提高了鹽脅迫下植株的存活率［28］。本研究通過擬南芥基因序列與棉花基因組數據庫比對，利用同源克隆的方法成功克隆出一個棉花ROP基因，命名為GhROP3，該基因的ORF長度為591 bp，編碼196個氨基酸，相對分子質量為21.75 kD，編碼的蛋白為堿性、親水性蛋白，定位于細胞膜，是非跨膜蛋白。為探究該基因是否具有與擬南芥AtROP相似的功能，本研究分析了GhROP3在低溫、干旱、高鹽處理和黃萎病菌侵染后基因的表達情況，結果表明，GhROP3在低溫脅迫下，基因表達量整體上呈現先升高再降低后升高的趨勢；在干旱、高鹽脅迫下和黃萎病菌處理后，該基因的表達量整體均呈現先上升后下降的趨勢；在這4種逆境脅迫處理中GhROP3的表達受干旱和黃萎病調控的程度較強，推測GhROP3可能更多地參與了棉花對干旱的脅迫反應和抗黃萎病反應。上述結果顯示在后續的研究中應該更多地關注GhROP3在棉花抗旱和抗黃萎病中的功能。組織特異性分析表明，GhROP3在棉花幼苗根、莖、葉、子葉和下胚軸中均有表達，但存在一定的組織特異性，GhROP3在莖中的表達量遠高于其它組織，以上結果推測棉花GhROP3棉花莖組織中發揮著重要的調控功能。然而GhROP3在棉花抗逆中的功能尚不清楚，為進一步探究該基因在棉花抗逆中的調控方式及調控的分子機制，本研究還構建了GhROP3的VIGS沉默載體并轉化棉花，獲得了沉默植株，以期進一步研究棉花GhROP3的生物學功能，本研究為棉花抗逆的重要基因資源挖掘及創制新材料奠定了基礎。

4 結論

克隆獲得1個小GTP結合蛋白基因GhROP3，其開放閱讀框為591 bp，編碼196個氨基酸，相對分子質量為21.75 kD，編碼蛋白為堿性、親水性蛋白，定位于細胞膜，是非跨膜蛋白。GhROP3在棉花幼苗根、莖、葉、子葉和下胚軸中均有表達，且在莖中表達水平較高。同時該基因響應高鹽、干旱、低溫和黃萎病菌等逆境脅迫。本研究獲得VIGS沉默植株。