突變及SUMO化修飾對DJ-1線粒體定位的影響

李麗芝， 周曉蘭， 唐北沙， 郭紀鋒

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種漸進性神經系統疾病，又稱震顫麻痹(Paralysis agitans)，以靜止性震顫、肌強直、動作遲緩和姿勢平衡障礙為主要特征。帕金森病的發病機制目前尚不清楚，研究認為可能與線粒體功能障礙、氧化應激、興奮性氨基酸毒性作用等有關[1～4]，且有研究發現PD有家族聚集現象，提示PD發病與遺傳因素有關[5，6]。DJ-1是常染色體隱性遺傳性帕金森病的致病基因[1]，該基因于2003年首次被發現與早發性帕金森綜合征(autosomal recessive early-onset parkinsonism，AREP)有關[1]。臨床上，帶有DJ-1突變的帕金森患者表現為早發運動遲緩、肌強直和震顫，在疾病后期出現焦慮、認知障礙等精神癥狀，對左旋多巴治療反應良好[1，7，8]。

人DJ-1基因定位于1p36.23，長23.86 kb，編碼含189個氨基酸高度保守的DJ-1蛋白[1，7，9]。DJ-1蛋白在生理條件下形成二聚體，廣泛表達于胰腺、腎臟、骨骼肌等組織，腦組織則在黑質、尾狀核、丘腦等與PD相關區域表達水平較高[10]。DJ-1參與機體感知并預防氧化應激，其缺失會加重氧化應激、內質網應激誘導的細胞死亡[11，12]。DJ-1目前在PD發病機制中的作用尚未闡明，Bonifati等發現DJ-1致病突變L166P可改變DJ-1在細胞內的分布，將DJ-1定位到線粒體上，導致細胞功能障礙，從而參與致病過程[1]。

SUMO-1也稱為PIC1(PML-interacting clone 1)，是一個101個氨基酸組成的多肽，與泛素具有低(18%)但顯著的同源性。SUMO-1修飾，稱為Sumoylation，與泛素化類似。在SUMO特異性蛋白酶與E1異二聚體酶、E2酶及E3酶共同參與下，經過成熟、活化、轉移、連接、解離等過程完成SUMO化和去SUMO化，改變修飾蛋白的穩定性和細胞內定位[3，13，14]。SUMO-1底物蛋白多含有ΨKxE或者ΨKxD模塊(Ψ代表疏水氨基酸，K代表賴氨酸，x代表任意氨基酸，E代表谷氨酸，D代表天冬氨酸)[14]。DJ-1蛋白含有ΨKxE模塊，且已被證明為SUMO-1的底物。

目前已發現SUMO-1與DJ-1神經變性中發揮作用，我們在前期研究中發現DJ-1的A39S突變導致細胞內基因表達改變，如UGT2B7表達下調，可能與PD發病機制有關[15]，猜測SUMO-1和DJ-1 A39S可能參與PD發病[16，17]。本研究構建DJ-1致病突變質粒，探討SUMO-1和sumoylation對DJ-1細胞內定位及PD發病機制的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 pcDNA3.1-hygro(-)-SUMO-1；pEGFP-N1 vector；pcDNA3.1-myc-DJ-1-WT，pcDNA3.1-myc-DJ-1-A39S；pGEX-5x-1-DJ-1-K130R；PCMV-Flag-2A；QIAGEN-tip-100，QIAprep Spin；EcoR I、Xho I、BgⅠⅡ、SalⅠ、Hind III、BamH I核酸內切酶，T4 DNA連接酶，Pyrobest酶等；引物；COS-7 細胞株；pEGFP-N1載體；ECL試劑盒；DMEM；胎牛血清；胰酶；EDTA；Lipofectamine 2000；GFP單克隆抗體；辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗鼠IgG；MitoTracker Deep Red 633；CY3-flag。

1.2 實驗方法

1.2.1 野生型、A39S突變型、K130R突變型、A39S-K130R雙突變DJ-1基因(pEGFP-N1-DJ-1-WT、pEGFP-N1-DJ-1-A39S、pEGFP-N1-DJ-1-K130R、pEGFP-N1-DJ-1-A39S-K130R)及SUMO-1基因(PCMV-Flag-SUMO-1)融合表達載體的構建 設計引物，PCR擴增引物，擴增目的基因片段，1%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物并切膠回收。雙酶切處理PCR純化產物并進行測序驗證，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產物。制備感受態JM109細菌，將5種質粒分別轉染JM109細菌，將細菌鋪于固體LB培養皿過夜，挑選白色克隆，手工法抽質粒后采用雙酶切及DNA測序驗證目的片段是否成功表達。檢測后，取驗證后的陽性克隆菌液，培養提取質粒并保存。

1.2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察DJ-1-EGFP融合蛋白的表達與分布 將COS-7細胞用培養于37 ℃，5% CO2培養箱中。轉染前一天，胰酶消化后接種在12孔板孔中繼續培養。細胞生長至80%～90%匯合時即可開始脂質體轉染。每孔轉1.2 μg質粒DNA，3 μl Lipofectamine 2000。操作按照Lipofectamine 2000說明書進行。COS-7細胞轉染表達載體后培養24 h，PBS洗一次，3.7%多聚甲醛固定后PBS洗3次。封片后用激光共聚焦顯微鏡斷層掃描并照相，用波長488 nm的激光激發。

1.2.3 熒光倒置顯微鏡觀察SUMO-1-Flag融合蛋白的表達與分布 接種、轉染COS-7細胞同前，PBS洗3次；-20 ℃預冷甲醇固定10 min，PBS-T洗3次。加入0.2%Triton-PBS室溫孵育10 min，PBS洗4次。加入5%BSA封閉液，室溫封閉1 h。加入與CY3聯合的抗Flag抗體(1∶250稀釋在封閉液中)，室溫孵育1 h，PBS洗5次，陰性對照不加抗體。加入1∶1000倍稀釋的Hoechst33258(稀釋在封閉液中)，室溫孵育10 min。封片后在熒光顯微鏡下觀察和照相。CY3經激發后發紅色熒光，Hoechst33258經激發后發藍色熒光。

1.2.4 Western Blot檢測DJ-1-pEGFP-N1和SUMO-1-Flag融合蛋白的表達 培養、轉染COS-7細胞，轉染細胞24 h后，PBS洗3次，每孔加入60μl(按照12孔板進行)2×loading buffer，孵育10 min，收集細胞裂解液。裂解液100 ℃水浴中變性10 min，冷卻后上樣跑膠。轉膜封閉后加一抗，洗去一抗后加二抗，洗去二抗后按ECL試劑盒說明書進行電化學發光檢測。

1.2.5 熒光染色分析技術檢測突變DJ-1蛋白的細胞定位情況 配置MitoTracker Deep Red 633，接種、轉染COS-7細胞。COS-7細胞培養24 h后，加入37 ℃預熱含有1.8 μM MitoTracker的培養基，在37 ℃，5% CO2培養箱中孵育40 min。染色后固定COS-7細胞，后用PBS洗3次，加入0.2%的PBS-T，室溫孵育5 min，用PBS洗3次。封片后用激光共聚焦顯微鏡掃描和照相。用波長488 nm和637 nm的激光激發，GFP經激發后發綠色熒光，MitoTracker經激發后發紅色熒光，雙色疊加后為黃色熒光，即共定位部分。

1.2.6 免疫熒光和激光共聚焦激光顯微鏡觀察SUMO-1-Flag和EGFP-DJ-1融合蛋白在細胞中的共定位情況 接種、轉染COS-7細胞，轉染分為pEGFP-N1和pCMV-Flag空質粒共轉組、pEGFP-N1空質粒和pCMV-Flag-SUMO-1共轉組、pCMV-Flag空質粒和pEGFP-N1-DJ-1共轉組及pEGFP-N1-DJ-1和pCMV-Flag-SUMO-1共轉組4組。培養24 h后用PBS洗3次，然后加入-20 ℃預冷甲醇固定10 min，用PBS-T洗3次。加入0.2%Triton-PBS室溫孵育10 min，然后用PBS洗4次。加入5%BSA封閉液室溫封閉1 h。加入與CY3聯合的抗Flag抗體(1∶250稀釋在封閉液中)，室溫孵育1 h，然后用PBS洗5次；陰性對照不加抗體。加入1∶1000倍稀釋的Hoechst33258(稀釋在封閉液中)，室溫孵育1 h。封片后用激光共聚焦顯微鏡掃描和照相。用波長488 nm和637 nm的激光激發，GFP經激發后發綠色熒光，CY3經激發后發紅色熒光，雙色疊加后為黃色熒光，即共定位部分。

2 結 果

2.1 穩定表達目的蛋白的COS-7細胞系的建立 經過轉染和篩選后，建立了穩定表達野生型和A39S、K130R突變型、A39S-K130R雙突變DJ-1蛋白及SUMO-1的COS-7細胞。經過測序、雙酶切及瓊脂糖凝膠電泳驗證構建質粒序列正確。4種DJ-1表達質粒均能表達DJ-1與EGFP的融合蛋白，而SUMO-1表達質粒也可表達SUMO-1-Flag融合蛋白。

2.2 DJ-1-pEGFP-N1融合蛋白及SUMO-1-Flag融合蛋白的表達與分布 DJ-1蛋白廣泛分布在細胞質和細胞核中，沒有明顯蛋白聚集物形成，野生型和各突變型相比無明顯差別，轉染pEGFP-N1載體的對照組細胞在胞質和胞核均有綠色熒光的表達。SUMO-1在細胞內位于細胞核內或核周的胞漿中，并且多以斑點狀形式存在，且Flag空載體未見有紅色熒光表達。

2.3 熒光染色分析技術檢測突變DJ-1蛋白的細胞定位情況 野生型和K130R型DJ-1蛋白部分分布在線粒體上，A39S和A39S-K130RDJ-1蛋白分布在胞漿中的則大部分轉移至線粒體上(見圖1)。即DJ-1基因致病突變改變了DJ-1蛋白的亞細胞定位，而EGFP沒有定位在線粒體上。

綠色為EGFP或DJ-1-EGFP融合蛋白，紅色為MitoTracker染色，示線粒體，黃色信號為兩種波長的熒光疊加所致，即共定位部分

2.4 免疫熒光和激光共聚焦激光顯微鏡觀察SUMO-1-Flag和EGFP-DJ-1融合蛋白在細胞中的共定位情況 四種DJ-1-EGFP蛋白均能正常表達和分布，pCMV-Flag空載體未見SUMO-1有表達，pEGFP-N1空載體未表達DJ-1。四種DJ-1-EGFP蛋白均與SUMO-1-Flag蛋白存在共定位信號，EGFP與SUMO-1沒有共定位，四種DJ-1-EGFP蛋白與pCMV-Flag也不存在共定位信號(見圖2)。

綠色為正常和突變的DJ-1-EGFP融合蛋白，紅色為SUMO-1-Flag融合蛋白，黃色信號為兩種波長的熒光疊加所致，即共定位部分

3 討 論

帕金森病(PD)是第二常見的神經退行性疾病，大約10%的PD病例與遺傳因素有關[18]。DJ-1基因是遺傳性帕金森病致病基因之一，具有細胞周期調節、控制基因轉錄和抵抗氧化應激等生理功能，但其導致PD發病機制尚未明確。SUMO-1與泛素具有顯著的同源性，但與泛素的生理功能不同，SUMO-1主要調控被修飾蛋白在細胞的分布、代謝及功能。DJ-1含有SUMO-1修飾底物-ΨKxE模塊，已確定為SUMO-1的底物蛋白[14]，研究表明sumoylation修飾可以干擾線粒體動力學，可能在PD的發病中起到作用[18]。Bonifati等研究也發現了DJ-1另一突變L166P致病突變會導致DJ-1蛋白在細胞內的分布發生改變，從胞漿轉移至線粒體上，導致DJ-1蛋白及線粒體功能障礙，導致PD的發生[1]。A39S與SUMO-1是否也會導致DJ-1蛋白亞細胞定位發生改變，引起DJ-1蛋白和線粒體功能障礙引起PD。

為了闡明DJ-1突變、DJ-1蛋白亞細胞定位、SUMO-1在PD致病機制中所起的作用，本研究構建了pCMV-Flag-SUMO-1、pEGFP-N1-DJ-1-WT、pEGFP-N1-DJ-1-A39S、pEGFP-N1-DJ-1-K130R、pEGFP-N1-DJ-1-A39S-K130R五種真核表達質粒。免疫熒光結果發現四種DJ-1蛋白中野生型及K130R突變型僅少部分分布于線粒體上，而A39S突變型及A39S-K130R型蛋白分布則由胞漿轉移至線粒體上，這表明DJ-1致病突變A39S及A39S-K130R突變改變了DJ-1蛋白在亞細胞結構的分布，并且主要轉移至線粒體上，可能引起DJ-1蛋白的結構及功能改變及線粒體功能障礙[19～21]。免疫熒光共定位發現外源性過表達的SUMO-1蛋白及4種DJ-1蛋白均存在共定位信號，這表明DJ-1與SUMO-1之間可能存在相互作用。因此，SUMO-1與DJ-1之間的相互作用及A39S突變可能影響DJ-1在亞細胞水平上的分布，導致DJ-1轉移至線粒體，影響DJ-1及線粒體功能，引起PD的發生。但這僅僅只是猜測，本研究并未確定DJ-1與SUMO-1之間存在相互作用，也無法確定該相互作用對DJ-1的影響，而DJ-1轉移至線粒體上對DJ-1、線粒體及整個細胞的影響也尚未可知。

本研究雖然通過免疫熒光及激光共聚焦技術發現DJ-1致病突變A39S會導致DJ-1蛋白的亞細胞定位發生改變，且SUMO-1與DJ-1可能存在相互作用，但是本實驗還是存在一些缺陷。首先，DJ-1蛋白轉移至線粒體后對DJ-1蛋白結構功能及線粒體功能的影響未作進一步研究，而DJ-1蛋白與細胞內其它細胞器的關系也缺乏進一步的了解。其次，雖然通過免疫熒光共定位確定了SUMO-1與4種DJ-1蛋白之間都存在共定位信號，但是確定蛋白之間存在相互作用需要結合免疫熒光共定位及免疫共沉淀來驗證，且DJ-1蛋白在胞漿及胞核內都廣泛分布，SUMO-1分布于細胞核內及核周，可能存在假陽性結果，因此，需要進一步免疫共沉淀結果才能確定SUMO-1與DJ-1之間存在相互作用。

綜上，本實驗成功構建了能在哺乳動物細胞內表達SUMO-1、野生型、A39S突變型、K130R突變型及A39S-K130R雙突變型DJ-1的真核表達質粒，在COS-1細胞內表達幾種質粒，發現DJ-1與SUMO-1存在共定位信號，提示兩者可能存在相互作用。最后，DJ-1致病突變A39S及A39S-K130R會使DJ-1蛋白從胞漿轉移至線粒體，為發現PD的發病機制提供了研究基礎。