LINC00612靶向結(jié)合Bcl-2抑制Aβ1-42孵育的神經(jīng)元凋亡

彭 乾， 趙德豐， 張 健， 薛一雪， 姜季委， 商秀麗

阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙為主要特征的慢性退行性疾病。β-淀粉樣蛋白(amyloid protein β，Aβ)沉積是AD主要的病理改變[1]。Aβ片段沉積會導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)AD發(fā)展[2]。LncRNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，在AD中發(fā)揮重要作用。例如，敲減SOX21-AS1能夠減弱對miR-107的分子海綿吸附作用，抑制Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡[3]；敲減SNHG1能夠降低KRENEN1表達(dá)，抑制Aβ25-35孵育的人原代神經(jīng)元和SH-SY5Y細(xì)胞凋亡[4]。Bcl-2在AD中的抗凋亡作用已經(jīng)明確[5]。本研究利用Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞建立AD神經(jīng)元損傷模型，研究旨在探討LINC00612對神經(jīng)元凋亡的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，為AD進(jìn)展提供新的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞來自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司細(xì)胞庫。細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM/F12(Gibco，美國)培養(yǎng)液中于37 ℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔板，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后根據(jù)Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。LINC00612過表達(dá)質(zhì)粒于上海吉瑪公司合成。

1.3 qRT-PCR 按照說明書使用PCR一步法試劑盒(Takara Bio，日本)進(jìn)行實驗。

LINC00612引物序列：

Forward：GGATCTCATCACCAGGCAAGCAC

Reverse：GTGACACTCCAAATCCCAGGAAGC

1.4 細(xì)胞活性檢測 將SH-SY5Y細(xì)胞接種到96孔板，24 h后，分別用0，1，2，4，8，16 μmol/L Aβ1-42于37 ℃，5% CO2環(huán)境中孵育24 h。隨后應(yīng)用CCK-8試劑盒(碧云天，中國)進(jìn)行細(xì)胞活力檢測。

1.5 Western blot 收集細(xì)胞并超聲裂解，BCA法測量蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，隨后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。PVDF膜用牛奶封閉2 h后，Bcl-2一抗(1：1000)，GAPDH(1：1000)孵育過夜。二抗室溫孵育2 h后發(fā)光，分析灰度值。

1.6 細(xì)胞凋亡實驗 使用Annexin V-FITC /PI(碧云天，中國)試劑盒進(jìn)行染色。收集待測細(xì)胞，加入Annexin V-FITC，室溫暗處溫育染色15 min，隨后加入PI染色5 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.7 RNA-pulldown實驗 使用RNA-pulldown試劑盒(碧云天，中國)進(jìn)行實驗，應(yīng)用western blot實驗檢測實驗結(jié)果?！?br>