α粒子與酒精聯(lián)合作用致肝細胞惡性轉(zhuǎn)化的影響

劉紅艷，王婧潔，張慧芳，黨旭紅，王 超，張忠新，張睿鳳，原雅藝，任 越，董娟聰，柴棟良，李幼忱

中國輻射防護研究院，山西 太原 030006

隨著我國核技術應用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，電離輻射對人類健康的影響越來越受到重視。α粒子由于具有較高的傳能線密度(LET)，會導致較強的相對生物效應能(RBE)，它對人體健康的影響一直是職業(yè)健康中關注的重點[1-4]。超鈾核素在核材料生產(chǎn)、MOX燃料制造、乏燃料后處理以及高放廢物處理與處置中對人體健康存在潛在風險[5-6]。超鈾核素半衰期長，比活度高，人體內(nèi)負荷小，主要考慮通過吸入或從皮膚進入體內(nèi)后產(chǎn)生的α粒子輻射能量沉積對組織器官的影響，肝臟是其重要的靶器官[7-8]。眾所周知，肝臟是人體代謝的主要場所，且?guī)缀跏蔷凭x的唯一場所，涉核工作人員的飲酒習慣是否會增加α粒子內(nèi)照射對人體的健康風險，目前沒有足夠的人群流行病學調(diào)查和實驗動物、細胞水平的數(shù)據(jù)支持[9-12]。在α粒子內(nèi)照射氡的健康評估中，已有流行病學研究表明氡與吸煙的聯(lián)合致肺癌作用存在協(xié)同效應，與部分細胞學和動物學實驗研究結果一致[13-16]。

因此本工作擬通過α粒子輻射體，建立體外細胞實驗，開展α粒子輻射、酒精單獨作用和兩者聯(lián)合作用肝細胞的實驗研究，從細胞生物學、分子生物學水平探討單因素、聯(lián)合因素對人肝細胞生物學效應的影響，為系統(tǒng)評價α粒子內(nèi)照射風險提供基礎數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 實驗細胞

LO2細胞是人正常肝上皮細胞構建成的永生化細胞系，購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 輻射源

蘇州大學241Am α粒子輻射源裝置，如圖1所示，α粒子源幾何尺寸為36 mm×4 mm，是有效直徑為20 mm的面源，其活度為5.7×106Bq，文獻[17]計算給出表面劑量率為0.138 Gy/min。面源與蓋玻片盤平行放置，兩者間距離為10 mm。

1.3 儀器和試劑

CO2細胞培養(yǎng)箱、酶標儀，Thermo 公司；超潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；實時熒光定量 PCR 擴增儀，Bio-Rad 公司；倒置相差顯微鏡，OLYMPUS公司；流式細胞儀，Beckman公司；高速冷凍離心機，Sigma公司。

RPMI-1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素，上海生工；Trizol(主要成分為苯酚，含有8-羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等抑制內(nèi)源和外源RNA酶)、RNA 反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑盒，天根公司；細胞周期試劑盒、CCK-8試劑盒，凱基生物；酒精，分析純，南京碧云天生物工程有限公司；Transwell板、Matrigel基質(zhì)膠，美國康寧公司。

1.4 實驗方法

1.4.1細胞培養(yǎng) LO2人肝細胞在37 ℃恒溫5%(體積分數(shù))CO2環(huán)境下的細胞培養(yǎng)箱中，用含10%(體積分數(shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，貼壁細胞生長至培養(yǎng)瓶底面積的80%～90%，經(jīng)0.25%(質(zhì)量分數(shù))胰蛋白酶消化，進行1∶3傳代，傳代一次計1代(P1)，培養(yǎng)細胞瓶于倒置相差顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。

1.4.2細胞生長增殖檢測 細胞生長增殖采用CCK-8試劑盒進行檢測，已廣泛應用于細胞毒理試驗。首先制作人肝細胞生長標準曲線，取對數(shù)生長期細胞，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞濃度，并將肝細胞密度分別調(diào)整為每毫升1萬個、2萬個、4萬個、8萬個、16萬個，每孔分別接種100 μL于96孔板進行培養(yǎng)，每組設置5個復孔。待接種細胞貼壁后，加入CCK-8試劑，37 ℃孵育3 h后，采用酶標儀于490 nm 波長處測量吸光度(OD)值。

1.4.3α粒子輻照劑量篩選 在文獻[18-19]調(diào)研的基礎上，初步確定了5個劑量點對肝細胞進行α輻照，劑量分別為0.05、0.10、0.25、1.00、2.00 Gy，根據(jù)輻照劑量=劑量率×輻照時間，α源的劑量率為0.138 Gy/min，計算出各實驗點所需輻照時間分別為21.7、43.5、108.7、434.8、869.6 s，輻照前細胞接種于已消毒的玻片上，濾紙吸控細胞表面培養(yǎng)基，將貼有細胞的玻片面朝α源，置于α粒子輻射源裝置輻照區(qū)卡槽內(nèi)。輻照完成后，玻片直接放入培養(yǎng)基，待細胞繼續(xù)生長數(shù)小時后進行消化轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。對照組細胞同時置于玻片接受假輻照(0 Gy)，輻照后48 h進行細胞增殖活力檢測，顯微鏡動態(tài)觀察細胞形態(tài)和生長狀況，篩選合適的輻照劑量進行后續(xù)α粒子輻照實驗。

1.4.4酒精作用濃度篩選 在文獻[20-22]調(diào)研的基礎上，根據(jù)中國人群飲酒習慣，計算血液和肝臟代謝酒精濃度，初步采用酒精濃度(體積百分比)0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0% 和7.0%的細胞培養(yǎng)基進行肝細胞酒精作用24 h，結束后換成正常培養(yǎng)基，進行細胞增殖活力檢測，顯微鏡動態(tài)觀察細胞形態(tài)和生長狀況，篩選合適的酒精濃度和作用時間進行后續(xù)酒精作用肝細胞實驗。

1.4.5聯(lián)合作用方式及實驗分組 根據(jù)α粒子輻射和酒精單因素作用模型，建立復合作用方式。實驗分為4組：對照組(不進行任何處理)；輻射組(單純α粒子輻照)；酒精組(單純酒精處理)；復合組(輻射組+酒精組，即細胞先經(jīng)α粒子輻照后再經(jīng)酒精作用處理)。實驗用細胞經(jīng)消化后進行傳代，采用相同代數(shù)的各組細胞，且均處于40代以內(nèi)，進行細胞生物學指標檢測。

1.4.6細胞生物學效應

(1) 流式細胞術檢測細胞周期

細胞周期是反映細胞生長增殖狀態(tài)的重要指標之一。采用PI染料進行DNA染色，利用流式細胞術檢測肝細胞周期。用Multicycle for windows 32-bit軟件統(tǒng)計分析人肝細胞在G0/G1、S、G2/M這3個不同時期的細胞占比。每個實驗樣品設3個平行樣，收集人肝細胞約1 × 106個，加入無水乙醇過夜固定肝細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline, PBS)清洗細胞去掉乙醇；加PI染料，室溫避光孵育30 min后，用流式細胞儀進行定量檢測。

(2) 細胞遷移和侵襲能力檢測

細胞遷移和侵襲實驗是反映細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的重要指標。采用Transwell實驗測定細胞遷移和侵襲能力。細胞遷移檢測：細胞接種于24孔板8 μm孔徑濾膜的chamber上室，下室加入500 μL含胎牛血清培養(yǎng)基，避免起泡產(chǎn)生。每個實驗組接種3個平行樣，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后終止，用0.1%(質(zhì)量分數(shù))結晶紫染色，棉簽擦去上室內(nèi)膜上的細胞，將Transwell小室反過來底朝上，顯微鏡下觀察小室底膜上附著細胞，隨機選取5～10個視野，顯微鏡拍照，記錄圖像中細胞數(shù)量。檢測細胞侵襲能力時，Transwell小室底部膜需要包埋 Matrigel基質(zhì)膠，將冰上緩慢溶解的Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按體積比1∶8稀釋后，加入小室底部，室溫待其凝固，再接種細胞懸液，其余步驟與細胞遷移檢測一致。采用Image J圖像處理軟件進行肝細胞數(shù)量自動計數(shù)。

(3) mRNA分子水平表達

采用實時熒光定量聚合酶鏈鎖反應(Real-time qPCR)測定肝細胞惡性轉(zhuǎn)化相關mRNA表達水平。在文獻[23-25]調(diào)研的基礎上，根據(jù)美國國家生物技術信息中心(NCBI)DNA序列數(shù)據(jù)庫GeneBank公布的序列，設計Real-time qPCR引物，結果列入表1。實驗細胞待生長至80%～90%，用PBS沖洗3遍后，直接加入Trizol試劑，提取細胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，并以此為模板進行 Real-time qPCR 檢測，每個樣本設置3個重復樣，結果采用ΔΔCT法進行分析。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果和討論

2.1 α粒子輻照劑量

LO2人正常肝細胞在含10%新生胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中正常生長，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，呈上皮樣、多角型，貼壁生長狀態(tài)。采用241Am放射源對肝細胞進行不同劑量(0.05、0.10、0.25、1.00、2.00 Gy)α粒子輻照，輻照后48 h檢測肝細胞存活分數(shù)，結果示于圖2。由圖2可知：與對照組(NC)比較，0.05 Gy組細胞活力差異不顯著(P>0.05)；0.10、0.25、1.00 Gy組肝細胞的存活分數(shù)低于對照組，差異不顯著(P>0.05)；2.00 Gy組肝細胞存活分數(shù)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，肝細胞接受2.00 Gy輻照后，連續(xù)培養(yǎng)72 h，50%的細胞呈懸浮狀態(tài)，出現(xiàn)明顯死亡。因此，選擇肝細胞存活分數(shù)幾乎不受影響的1.00 Gy輻射劑量進行單因素α粒子輻照細胞，記為輻射組。

圖2 不同劑量輻照48 h后對肝細胞存活分數(shù)的影響

2.2 酒精作用濃度

采用含酒精濃度(體積百分比)分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%和7.0%的細胞培養(yǎng)基作用于肝細胞，與對照組比較，結果示于圖3。由圖3可知：酒精作用24 h后，0.5%和1.0%酒精作用組肝細胞存活分數(shù)低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)；2.0%和3.0%酒精作用組肝細胞存活分數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在作用5 min后，長梭型貼壁細胞變圓，4 h 后形態(tài)恢復正常；4.0%～7.0%酒精作用組肝細胞存活分數(shù)顯著低于對照組。因此，選擇肝細胞存活分數(shù)幾乎不受影響的1.0%酒精進行作用，記作酒精組。

圖3 不同濃度酒精處理24 h后對肝細胞存活分數(shù)的影響

2.3 α粒子與酒精聯(lián)合作用人肝細胞

在以上篩選的單因素輻射和酒精作用肝細胞模型的基礎上，進行α粒子輻照和酒精聯(lián)合作用，組成了復合作用方式：細胞先接受α粒子輻照后再經(jīng)酒精作用。輻照劑量為1.00 Gy/次，累計輻照兩次后經(jīng)酒精作用，采用含1.0%酒精濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每代進行一次酒精處理，隔三天傳代一次。

2.4 細胞生物學效應

2.4.1細胞周期 流式細胞術檢測各實驗組肝細胞周期示于圖4。由圖4可知：與對照組比較，輻射組S期細胞比例增加(P<0.05)、G2/M期細胞比例減少(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義；酒精組與復合組肝細胞處于G0/G1期的細胞比例均減少、S期細胞比例均增加，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。輻射組與酒精組比較，G0/G1期細胞比例增加、S期和G2/M期細胞比例減少，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。復合組與輻射組比較，G0/G1期細胞比例減少、S期細胞比例增加，且有顯著性差異(P<0.05)，各組的肝細胞周期百分比結果示于圖5。由圖5可知：輻射組細胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯，DNA復制前的檢查修復需要更長時間，與輻射致DNA損傷有關。與單因素組相比，復合組肝細胞G1期逃逸至S期，細胞周期失衡。

(a)——對照組，(b)——酒精組，(c)——輻射組，(d)——復合組

■——G0/G1，□——S，——G2/M

2.4.2細胞遷移和細胞侵襲 Transwell實驗測定各實驗組肝細胞發(fā)生遷移和侵襲的細胞數(shù)量示于圖6。由圖6可知：與對照組比較，輻射組、復合組肝細胞均發(fā)生了細胞遷移，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與酒精組比較，輻射組發(fā)生遷移的細胞數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，復合組發(fā)生遷移和侵襲的細胞數(shù)量也均增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05、P<0.001)；與輻射組比較，復合組發(fā)生侵襲的細胞數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，復合組發(fā)生侵襲的細胞數(shù)量最大，有著明顯的惡性轉(zhuǎn)化趨勢，提示α粒子輻照后再進行酒精處理，酒精增加了肝細胞的侵襲能力，誘導細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

(a)—(d)、(f)—(i)為顯微鏡成像圖片

2.4.3分子生物學效應 用實時熒光定量聚合酶鏈鎖反應(Real-time qPCR)的方法，檢測與細胞惡性轉(zhuǎn)化相關的抑癌基因p53和原癌基因mdm2、細胞粘附蛋白相關基因cdh1在mRNA水平的表達，結果示于圖7。由圖7可知：與對照組比較，單因素和復合組細胞p53基因和cdh1基因在mRNA水平表達降低，mdm2基因表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與酒精組比較，復合組肝細胞p53、cdh1和mdm2基因表達有顯著差異(P<0.001)；與輻射組細胞比較，復合組細胞p53基因和mdm2基因表達有顯著差異(P<0.05)，提示α粒子和酒精均誘導肝細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化趨勢，復合作用明顯高于單因素作用，即輻照后酒精的作用促進了肝細胞原癌基因mdm2的高表達和抑制了抑癌基因P53的表達，從分子水平介導肝細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

■——NC，——酒精組，□——輻射組，——復合組

3 結 論

研究發(fā)現(xiàn)α粒子輻射和酒精均能誘導肝細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化趨勢，復合因素作用下肝細胞原癌基因mdm2高表達，抑癌基因p53和細胞粘附相關基因cdh1低表達，發(fā)生明顯的惡性轉(zhuǎn)化趨勢。提示α粒子輻照后再進行酒精作用的肝細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的風險增高，可能是酒精影響了肝細胞表面E型粘連蛋白的表達，導致細胞之間粘連性降低，促進細胞發(fā)生遷移和侵襲。因此，在評價α粒子內(nèi)照射對健康的影響時需要考慮職業(yè)人員的飲酒習慣。