不同Sap酶活性的白假絲酵母菌對陰道上皮細胞表達NLRP3炎性小體的影響

侯夢瑤，邵明琨，羅丹丹，祁文瑾

外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)是由假絲酵母菌引起的女性下生殖道最常見的感染性疾病之一，居女性生殖道炎癥第二位病因，白假絲酵母菌是最常見的致病菌種，屬于機會致病菌，健康狀態下，在陰道的微環境中與宿主和其他局部微生物群處于共生狀態，其中某個因素改變都容易導致平衡被打破，假絲酵母菌由酵母相變為菌絲相而致病，對陰道黏膜造成損傷。陰道局部免疫系統被激活，發動先天性和適應性免疫保護機體。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3[nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor family pyrin domain containing 3, NLRP3]炎性小體就是其中關鍵的因子，可以被白假絲酵母菌的主要毒力因子之一分泌型天冬氨酸蛋白酶(secreted of aspartic proteases, Sap)所激活。它是一種蛋白復合體，屬于機體先天免疫的一部分。當受到損傷因子刺激后，NLRP3蛋白與銜接子凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain, ASC)相互作用啟動炎性小體形成，ASC同時募集并激活效應子半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1(cysteiny aspartate specific protease-1, caspase-1)前體以產生活性的caspase-1，caspase-1剪切白細胞介素(interleukin, IL)-1β前體和IL-18前體形成具有生物學活性的IL-1β和IL-18，從而觸發一系列的炎癥反應。該研究主要探索不同Sap酶活性的白假絲酵母菌對人和小鼠陰道上皮細胞表達NLRP3炎性小體、IL-1β和IL-18的影響，期望能為進一步明確VVC的發病機制提供新的研究理論。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

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生物材料 白假絲酵母菌來源于昆明醫科大學第一附屬醫院婦產科門診的VVC患者；人陰道上皮組織來自同一醫院的婦科子宮肌瘤或子宮腺肌癥行全子宮切除患者，患者未絕經且既往身體健康，以上均取得患者知情同意，通過本院倫理委員會批準。小鼠購自昆明醫科大學SPF動物房，雌性昆明小鼠，6～8周齡，體質量22～28 g。

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主要試劑 沙堡羅氯霉素培養基(法國生物梅里埃公司)；念珠菌顯色平板(上海安圖生物公司)；無菌脫脂奶粉(上海生物工程股份有限公司)；角化細胞無血清培養基(K-SFM，美國Gibco公司)； DMEM/F12完全培養基(美國Gibco公司)；中性蛋白酶(DispaseⅡ，美國Sigma公司)；胰酶(美國Gibco公司)；NLRP3炎性小體抗體(anti-NLRP3 antibody，杭州華安生物技術有限公司)；牛血清白蛋白V(美國Solarbio公司)；免疫熒光二抗、DAPI(美國Invitrogen公司)；人IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒及小鼠IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒(深圳欣博盛科技有限公司)；改良HE染色試劑盒(美國Solarbio公司)。

1.2 實驗方法

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假絲酵母菌純化、菌種鑒定及Sap酶活性檢測 純化：用無菌棉拭子將VVC患者陰道分泌物接種到沙堡羅培養皿上，培養48 h后分離單菌落擴增保存。菌種鑒定：嚴格按安圖念珠菌顯色平板說明書進行鑒定。Sap酶活性測定：將配成5×10CFU/ml濃度的菌液滴到牛奶培養皿固定位置，長出菌落圈和沉淀圈后用游標卡尺測量直徑并計算出比值，以PA值(菌落圈直徑/菌落圈直徑+沉淀圈直徑)表示，每個菌以3個結果的平均值來計算Sap酶活性。

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陰道上皮細胞培養 取人和小鼠新鮮陰道組織后采用DispaseⅡ和胰酶分步消化法，DispaseⅡ浸泡4 ℃冰箱過夜。分離陰道黏膜層并剪碎，0.25%胰酶37 ℃消化、DMEM/F12完全培養基終止消化，離心后K-SFM培養液重懸細胞并計數，按1×10個/ml的濃度將細胞接種于25 cm細胞培養瓶中，置于37 ℃、5%CO培養箱培養。48 h后觀察細胞生長情況并首次換液，每隔2～3 d換液并觀察細胞。當貼壁細胞數達70%～80%時進行傳代，按1×10個/ml的濃度將細胞接種于24孔板內培養，貼壁細胞數達70%～80%時進行下一步。

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陰道上皮細胞與白假絲酵母菌共培養 白假絲酵母菌菌液配置：K-SFM培養液配置菌液，濃度為1×10CFU/ml。細胞與菌共培養：實驗分為3組進行，分別為空白對照組(只加K-SFM培養液)、Sap酶活性強組和Sap酶活性弱組。分別于6、12、24、48 h將配好的菌液加入到相應孔內，空白對照孔由K-SFM培養液代替，37 ℃、5%CO培養箱培養。48 h后同時收取上清液，-80 ℃冰箱避光保存，24孔板內的細胞用PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定,4 ℃冰箱保存。

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免疫熒光法檢測陰道上皮細胞NLRP3炎性小體的表達 取已用4%多聚甲醛固定的細胞，檸檬酸鹽修復液修復后加通透液，PBS清洗，5%牛血清白蛋白37 ℃封閉，再加NLRP3炎性小體抗體(1 ∶100稀釋)4 ℃冰箱過夜，復溫后PBS清洗，按說明加入稀釋熒光二抗(1 ∶500稀釋)，37 ℃孵育，加入DAPI染色9 min，PBS清洗后熒光顯微鏡下觀察并拍照。每個組選7～8張圖用Image Pro Plus軟件做熒光定量，并根據細胞核的數量進行熒光均一化處理后再做統計學分析。

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ELISA法檢測上清液中細胞因子IL-1β、IL-18的表達 復溶已收取的細胞上清液,分別取100 μl并嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，作出標準曲線并根據其最后計算出IL-1β、IL-18的實際濃度。

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HE染色觀察細胞形態 取已用4%多聚甲醛固定的細胞，PBS清洗后用蘇木精染色2 min，蒸餾水清洗，分化液分化后加反藍液，自來水清洗，伊紅染色20 s后95%乙醇溶液2～3 s，無水乙醇3 min(重復2次)，鏡下觀察細胞并拍照。

2 結果

2.1 假絲酵母菌鑒定情況及Sap酶活性檢測結果

在念珠菌顯色平板上長出的菌落顯色為綠色或翠綠色則為白假絲酵母菌。牛奶培養基平皿上可看到菌落圈和沉淀圈即為Sap陽性菌株，PA值越低，表明菌株Sap酶活性越強，反之則越弱。挑選Sap酶活性弱(PA=0.634±0.019)與Sap酶活性強(PA=0.254±0.003)的白假絲酵母菌各8株，測定的Sap酶活性強弱差異有統計學意義(

F

=380.44，

P

<0.05)。見圖1。

圖1 純化鑒定及Sap酶活性測定A：用安圖念珠菌顯色培養板進行菌種鑒定；B：牛奶培養基進行Sap酶活性測定；藍色圈：菌落圈；紅色圈：沉淀圈

2.2 陰道上皮細胞培養情況

人陰道上皮細胞消化后傳到培養瓶中，6～7 d時貼壁細胞數可達70%～80%，而小鼠陰道上皮細胞只需4～5 d；細胞呈鋪路石樣生長，形態為多角形，輪廓清晰，折光線好，確認為陰道上皮細胞。見圖2。

圖2 光學顯微鏡觀察細胞培養第6天的形態 ×100A：人陰道上皮細胞；B：小鼠陰道上皮細胞

2.3 NLRP3炎性小體檢測結果

人陰道上皮細胞與白假絲酵母菌共培養后，陰道上皮細胞表達的NLRP3炎性小體水平從6 h開始升高，12 h達高峰后逐漸下降；同時熒光圖片顯示共培養24 h后，陰道上皮細胞開始裂解，至48 h時可看到細胞破裂死亡，熒光隨之減弱，而空白對照組的細胞形態從始至終都是完整的，熒光量保持相對穩定，Sap酶活性強組NLRP3炎性小體水平下降趨勢更明顯。此外，人陰道上皮細胞與白假絲酵母菌共培養6、12、48 h，Sap酶活性弱組和Sap酶活性強組與空白對照組的NLRP3炎性小體水平相比差異有統計學意義(

P

<0.05)。Sap酶活性強組在12 h時與Sap酶活性弱組的NLRP3炎性小體水平差異有統計學意義(

F

=8.05，

P

<0.05)，但6、24、48 h兩組間的NLRP3炎性小體表達差異無統計學意義。見圖3。

圖3 人陰道上皮細胞NLRP3炎性小體表達量 ×400A：空白對照組；B：Sap酶活性弱組；C：Sap酶活性強組；D：三組熒光表達；綠色熒光：NLRP3炎性小體；藍色熒光：DAPI核染色；與空白對照組比較：*P<0.05；與Sap酶活性弱組比較： #P<0.05

2.4 IL-1β、IL-18的測定結果

白假絲酵母菌與人陰道上皮細胞共培養6、12、24、48 h，IL-1β和IL-18水平均在6 h達峰值后逐漸下降趨勢，至48 h時隨著細胞膜的破裂，細胞內IL-1β和IL-18全部被釋放出來，又出現了小幅度的回升。Sap酶活性強組IL-1β和IL-18水平在6、12、48 h與空白對照組相比差異有統計學意義(

F

=24.40、8.38，

P

<0.05)，兩因子3組間

F

值分別為24.40、8.38；而Sap酶活性弱組僅有IL-1β水平在6、12、24 h與空白對照組差異有統計學意義(

P

<0.05)，Sap酶活性強組IL-1β和IL-18水平在6、12、48 h與Sap酶活性弱組相比差異有統計學意義(

P

<0.05)。見圖4。

圖4 人陰道上皮細胞IL-1β和IL-18的表達量與空白對照組比較：*P<0.05；與Sap酶活性弱組比較：#P<0.05

2.5 HE染色結果

空白對照組的細胞邊界清晰，飽滿，折光性好；而陰道上皮細胞與白假絲酵母菌共培養48 h后可看到大部分細胞邊界模糊，部分已裂解，活力較差。見圖5。

圖5 光學顯微鏡觀察HE染色人陰道上皮細胞形態 × 400A：空白對照組B：白假絲酵母菌與陰道上皮細胞共培養48 h

2.6 小鼠陰道上皮細胞3種因子表達情況

小鼠陰道上皮細胞與不同Sap酶活性的白假絲酵母菌共培養12 h，NLRP3炎性小體、IL-1β、IL-18 3種因子水平均高于空白對照組(

F

=32.3、10.39、11.13，

P

<0.05)，各個因子3組間

F

值分別為32.03、10.39、11.13，Sap酶活性強組的表達水平均高于Sap酶活性弱組(

P

<0.05)。趨勢與人陰道上皮細胞一致。見圖6。

圖6 小鼠陰道上皮細胞12 h時間點各因子表達量A：空白對照組；b：Sap酶活性弱組；c：Sap酶活性強組；與空白對照組比較：*P<0.05；與Sap酶活性弱組比較： #P<0.05

3 討論

Sap是由白假絲酵母菌分泌的一種胞外水解酶，有助于致病菌黏附、侵入宿主黏膜屏障和逃逸宿主免疫的攻擊。有研究表明，Sap基因缺失的突變菌造成的上皮損傷較輕且產生的細胞因子也會下降。因此Sap酶活性長期以來都被認為是致病白假絲酵母菌的重要毒力特征，且對激活NLRP3炎性小體至關重要。本研究選取白假絲酵母菌與體外陰道上皮細胞共培養，結果顯示NLRP3炎性小體水平早期即達高峰，之后隨著細胞的破壞、死亡，表達量逐漸下降。由此活化的IL-1β和IL-18可分別驅動Th17和Th1細胞的早期分化，Th1主要通過分泌IFN-γ募集巨噬細胞等發揮抗感染作用，Th17分泌IL-17和IL-23等細胞因子抵御假絲酵母菌感染，NLRP3炎性小體缺陷的小鼠對白假絲酵母菌的播散性和易感性都增加了。所以，NLRP3炎性小體作為先天免疫系統的重要成員，在感染早期可立即啟動保護性適應性免疫反應抵御病菌。

然而，NLRP3炎性小體若被過度激活,一方面，引發的炎癥細胞因子和趨化因子不僅不能充分殺滅真菌降低陰道上皮細胞的損傷，反而使陰道上皮處于高炎癥狀態，導致免疫病理性炎癥。另一方面， NLRP3炎性小體可裂解并激活成孔蛋白gasdermin D，從而在質膜上形成孔導致細胞焦亡，該機制可能造成細胞大量死亡。本研究選取不同Sap酶活性的白假絲酵母菌與陰道上皮細胞共培養，發現NLRP3炎性小體、IL-1β和IL-18的水平均高于空白對照組，說明白假絲酵母菌能刺激陰道上皮細胞表達更多的NLRP3炎性小體及相關因子，且這個表達量與白假絲酵母菌的Sap酶活性成正比。推測Sap酶活性強的菌可能誘導NLRP3炎性小體的過度表達，引發高炎癥反應及細胞死亡，從而導致陰道的局部病理損傷更嚴重。最后，本研究還發現不同Sap酶活性的白假絲酵母菌感染小鼠陰道上皮細胞后，與人陰道上皮細胞免疫因子表達的趨勢基本一致，因此可以用小鼠代替人進行VVC體內實驗。

綜上所述，在VVC的發病機制中，NLRP3炎性小體可能是一把雙刃劍，激活后既能通過活化IL-1β和IL-18啟動機體的保護性免疫應答，又可能因過度激活而造成機體的免疫病理狀態。不同Sap酶活性的白假絲酵母菌與陰道上皮細胞共培養后，對NLRP3炎性小體的激活程度不完全一致，所以Sap酶活性強的菌可能更容易造成免疫病理損傷，引起的臨床癥狀可能更嚴重，這也許是臨床上不同VVC患者臨床癥狀和體征存在差異的原因。但體外實驗并不能完全反映體內陰道黏膜局部的免疫狀態，還需進一步的體內實驗來論證這一觀點，從本研究結果來看，小鼠可以代替人進行這一部分的體內實驗。