皮膚軟組織感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌SCC mec分型和同源性分析

汪軒軒，黃 穎，胡媛媛，陳 鶴，王中新，徐元宏

皮膚軟組織感染(skin and soft tissue infections，SSTI)是化膿性病原菌感染表皮、真皮及皮下組織引起的炎癥性疾病，包括從淺表性感染至壞死性感染。有研究表明壞死性SSTI截肢率為12%～20%，死亡率為6%～33%。引起SSTI最常見(jiàn)致病菌是金黃色葡萄球菌，其中25%為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)。MRSA中的葡萄球菌染色體mec盒(SCC mec)是一個(gè)可移動(dòng)的遺傳元件，包含兩個(gè)基本的遺傳成分(mec基因復(fù)合體和ccr基因復(fù)合體)。根據(jù)mec和ccr基因復(fù)合體組合SCCmec可分為 I～V型。SCC mec中含有多種耐藥基因和位于mec基因復(fù)合體的甲氧西林耐藥(mecA)基因，與MRSA的傳播和多重耐藥密切相關(guān)。通過(guò)SCC mec類型可區(qū)分醫(yī)院獲得性MRSA(HA-MRSA)和社區(qū)獲得性MRSA(CA-MRSA)。因此，SCCmec分型做為一種分子工具是了解MRSA分子流行病學(xué)的基礎(chǔ)。現(xiàn)對(duì)SSTI住院患者分離的MRSA菌株進(jìn)行SCC mec分型并了解其耐藥情況，同時(shí)分析菌株間的同源性，為臨床合理規(guī)范使用抗生素及醫(yī)院感染控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集2019年6月-2020年9月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科保存的從SSTI患者中分離的MRSA共44株，剔除同一患者相同部位分離的重復(fù)菌株，其中HA-MRSA 40株，CA-MRSA 4株。陰性質(zhì)控菌株為ATCC25923，陽(yáng)性質(zhì)控為ATCC43300。CA-MRSA的判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染防治專家共識(shí)》：從門診、住院48 h內(nèi)的患者中分離的MRSA菌株，既往無(wú)MRSA感染和定植病史，無(wú)留置導(dǎo)管或經(jīng)皮的醫(yī)療裝置，無(wú)血透和手術(shù)史，1年內(nèi)未住入醫(yī)院、養(yǎng)老院。不符合上述標(biāo)準(zhǔn)判斷為HA-MRSA。

1.2 儀器與試劑

1

.

2

.

1

主要儀器 東勝龍ETC 811基因擴(kuò)增儀(蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司);MULTIFUGE X1R高速冷凍離心機(jī)、HERAcell-240i CO培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛世爾科技公司); DYY-60型電泳儀(北京六一生物科技有限公司);JS-2000紫外線凝膠成像儀(上海培清科技有限公司); Vitek 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀、Vitek MS質(zhì)譜儀(法國(guó)梅里埃公司)。

1

.

2

.

2

主要試劑 Mlutiplex PCR Kit(德國(guó)QIAGEN生物公司);2×Pro Taq Master Mix含染料、GL DNA marker 2000、GoldView核酸凝膠染料、瓊脂糖凝膠(湖南艾科瑞生物有限公司);哥倫比亞血平板(合肥天達(dá)診斷試劑有限公司); GL DNA marker 1000(山東思科捷生物技術(shù)有限公司)；藥敏紙片(英國(guó)Oxoid公司);引物購(gòu)自上海生工生物公司。

1.3 方法

1

.

3

.

1

MRSA鑒定及藥敏分析 菌株復(fù)蘇后四區(qū)劃線接種在哥倫比亞血平板上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h，挑取單個(gè)菌落用Vitek MS質(zhì)譜儀重新鑒定。藥敏結(jié)果采用頭孢西丁藥敏紙片擴(kuò)散(K-B)法和革蘭陽(yáng)性球菌藥敏卡片在Vitek 2 Compact儀器上分析。結(jié)果判讀根據(jù)2018年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。

1

.

3

.

2

提取模板DNA 挑取單個(gè)菌落5～8個(gè)于200 μl無(wú)菌去離子水中，在漩渦混合器上振蕩混勻20 s,置于干式恒溫器中100 ℃加熱20 min，高速離心機(jī)15 000 r/min離心10 min,取100 μl上清液轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌EP管中即為DNA模板。

1

.

3

.

3

檢測(cè)mecA基因 采用PCR方法檢測(cè)模板DNA的mecA基因，引物序列參考文獻(xiàn)見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為25 μl，包括2×Pro Taq Master Mix 12.5 μl，上下游引物(10 μmol /L)各1 μl，模板DNA 4 μl,無(wú)菌去離子水6.5 μl。反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s預(yù)變性;98 ℃ 10 s變性、50 ℃ 30 s退火、72 ℃ 1 min退火,35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min最終延伸。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，置于紫外凝膠成像儀下觀察，陽(yáng)性菌株確證為MRSA。

表1 mec A基因和SCC mec分型引物序列表

1

.

3

.

4

SCC mec分型 采用多重PCR方法對(duì)模板DNA進(jìn)行SCC mec分型，各引物序列參考文獻(xiàn)見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為25 μl，包括2×QIAGEN Mlutiplex PCR Master Mix 12.5 μl,引物混合液(2 μmol /L)2.5 μl，模板DNA 4 μl，無(wú)菌去離子水6 μl。反應(yīng)條件為95 ℃ 15 min預(yù)變性;94 ℃ 30 s變性、57 ℃ 90 s退火、72 ℃ 90 s延伸,35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min最終延伸。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，置于紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

1

.

3

.

5

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI

-

TOF MS)同源性分析 菌株復(fù)蘇后接種在哥倫比亞血平板上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h，無(wú)菌接種環(huán)挑取少量菌落厚薄均勻涂布于靶板上，在菌膜未干燥時(shí)用1 μl CHCA基質(zhì)液均勻覆蓋菌膜表面，自然晾干后置于Vitek MS質(zhì)譜儀上采用RUO模式檢測(cè)。通過(guò)LaunchPad獲得質(zhì)譜，結(jié)果實(shí)時(shí)發(fā)送至SARAMIS,并通過(guò)VITEK MS SARAMIS Premium軟件查看。將獲得的圖譜導(dǎo)入圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行聚類分析，相似度< 70%的結(jié)果認(rèn)為是不同的質(zhì)譜型別。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用WHONET 5.6軟件分析藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，卡方檢驗(yàn)確切概率法比較不同SCC mec類型MRSA耐藥率的差異，

P

<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SSTI患者一般臨床資料

44例SSTI患者中男性30例，女性14例，男女比例為2.1 ∶1。年齡為10個(gè)月～80歲，平均(42.59±21.96)歲，感染類型中術(shù)后切口感染17例(38.63%)、燒傷感染14例(31.82%)、皮疹和皮膚膿皰瘡7例(15.90%)、外傷創(chuàng)面感染3例(6.82%)、骨髓炎2例(4.54%)、受壓區(qū)壓瘡1例(2.27%)。

2.2 mecA基因檢測(cè)結(jié)果

44株MRSA進(jìn)行經(jīng)PCR擴(kuò)增后mecA基因均為陽(yáng)性，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 mecA檢測(cè)結(jié)果M：GL DNA Marker 2000；1～6：隨機(jī)抽取的菌株標(biāo)本；7：陽(yáng)性質(zhì)控ATCC43300；8：陰性質(zhì)控ATCC25923

2.3 SCC mec分型結(jié)果

經(jīng)過(guò)多重PCR擴(kuò)增后共分出Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa三種類型。其中Ⅱ型5株(11.36%)、Ⅲ型12株(27.27%)、Ⅳa型8株(18.18%)、未分型19株(43.18%)，各分型電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。已分型的25株MRSA中包含22株HA-MRSA和3株CA-MRSA，HA-MRSA中Ⅱ型5株(22.73%)、Ⅲ型11株(50.00%)、Ⅳa型6株(27.27%)，CA-MRSA中Ⅲ型1株(33.33%)、Ⅳa型2株(66.67%)。

圖2 SCC mec檢測(cè)結(jié)果A、B、C：SCC mec Ⅲ、Ⅱ、Ⅳa型電泳條帶；M:GL DNA Marker 1000；1～4：各型別隨機(jī)抽取的4株標(biāo)本

2.4 MALDI-TOF MS同源性分析

通過(guò)VITEK MS SARAMIS Premium軟件對(duì)44株MRSA的蛋白圖譜進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建發(fā)育樹(shù)。根據(jù)各菌株間相似度小于70%為不同類型的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判別，44株MRSA分為兩大簇；21號(hào)菌株為一簇，其他43株標(biāo)本為另一簇，結(jié)果見(jiàn)圖3，其中不同相似度的菌株科室分布見(jiàn)表2。

表2 不同相似區(qū)間的菌株科室分布表

圖3 44株MRSAMALDI-TOF MS同源性分析

2.5 不同SCC mec類型的MRSA耐藥結(jié)果

不同SCC mec類型MRSA對(duì)青霉素、苯唑西林、頭孢西丁等β-內(nèi)酰胺類抗生素均表現(xiàn)為耐藥，對(duì)利奈唑胺和萬(wàn)古霉素均表現(xiàn)出敏感。3種類型的MRSA對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素和莫西沙星的耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 不同SCC mec類型MRSA的耐藥率(%)

3 討論

本研究44例住院患者中38.63%為術(shù)后切口，38.63%為燒傷感染，主要由于皮膚屏障破壞，創(chuàng)面微環(huán)境形成了感染的溫床，部分患者同時(shí)存在免疫力低下、糖尿病、慢性腎功能不全等高危因素。早期識(shí)別MRSA SSTI的高危人群并采取合理的治療措施至關(guān)重要。

SCC mec基因目前主要分為 Ⅰ～Ⅴ型，本研究結(jié)果以Ⅲ型(27.27%)為主，其次為Ⅳa型(18.18%)和Ⅱ型(11.36%)，與國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。但國(guó)內(nèi)部分地區(qū)和日本以Ⅱ型為主，說(shuō)明不同國(guó)家和地區(qū)有較大的差異。本研究中未分型菌株占43.18%，高于國(guó)內(nèi)部分報(bào)道，可能與以下原因有關(guān)：① 由于部分菌株保存條件不當(dāng)導(dǎo)致耐藥基因缺失；② 隨著不同抗菌藥物的使用導(dǎo)致SCCmec出現(xiàn)新的型別或者亞型，目前實(shí)驗(yàn)條件尚未檢測(cè)到，需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究中共有HA-MRSA 40株，CA-MRSA 4株，說(shuō)明本院以HA-MRSA感染為主。雖然研究表明HA-MRSA以SCCmec Ⅰ-Ⅲ型居多，CA-MRSA以SCCmec Ⅳ、V型居多，但本院SSTI患者中HA-MRSA Ⅳa型的比例(27.27%)超過(guò)了Ⅱ型(22.73%)，CA-MRSA中也出現(xiàn)了Ⅲ型(33.33%)，可見(jiàn)隨著患者在社區(qū)和醫(yī)院之間不斷流動(dòng)，HA-MRSA 與CA-MRSA 差異逐漸縮小。我國(guó)也有文獻(xiàn)報(bào)道由Ⅳ、V 型引起的醫(yī)院獲得性感染正逐年增加，有超過(guò)由Ⅲ型引起醫(yī)院獲得性感染的趨勢(shì)。其機(jī)制尚不明確，可能和以下原因有關(guān)：① Ⅳ、V型攜帶的耐藥基因小，更容易對(duì)抗生素做出適應(yīng)性改變；② Ⅳ、V型更有可能攜帶殺白細(xì)胞素(PVL)基因；③ Ⅳ、V型和 Ⅰ-Ⅲ型菌株相比，可表達(dá)更高水平的RNA Ⅲ，它是輔助基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)(Agr)效應(yīng)器，調(diào)節(jié)多種毒素的表達(dá)，在未接觸抗生素的情況下保持毒力，接觸抗生素后可用Agr活性來(lái)?yè)Q取對(duì)甲氧西林的耐藥性。

本研究顯示SCCmec Ⅲ型和Ⅱ型總體耐藥率較高，Ⅳa型相對(duì)較低，三種類型的MRSA對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素和莫西沙星的耐藥率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。原因是Ⅱ型和Ⅲ型由于分子結(jié)構(gòu)長(zhǎng)，攜帶多種耐藥基因呈多重耐藥性，而 HA-MRSA中的Ⅳ型除 mecA 以外攜帶其他耐藥基因較少。

本研究采用MALDI-TOF MS進(jìn)行同源性分析將44株MRSA分為兩大簇，其中43株均在一簇，僅21號(hào)菌株在另一簇，表明本院SSTI患者中的MRSA具有高度同源性。本研究中有7株MRSA相似度達(dá)到100%，并分布在不同病區(qū)，說(shuō)明可能存在同一菌株在不同病區(qū)之間相互傳播。從表2可以看出在不同相似區(qū)間，來(lái)自燒傷科的菌株均多于其他病區(qū)，因此燒傷科更應(yīng)提高醫(yī)務(wù)人員和患者控制感染的意識(shí)，嚴(yán)格執(zhí)行消毒隔離制度，加強(qiáng)病區(qū)病原菌監(jiān)測(cè)，避免細(xì)菌院內(nèi)爆發(fā)感染。

4株CA-MRSA編號(hào)分別為33、14、29、3，其中33號(hào)菌株在70%～80%相似區(qū)間，14號(hào)菌株在80%～90% 相似區(qū)間，29號(hào)和3號(hào)菌株在90%～100%相似區(qū)間。查閱病史29號(hào)、3號(hào)菌株患者近兩個(gè)月均有規(guī)律的醫(yī)療機(jī)構(gòu)接觸史，可能是造成與HA-MRSA菌株相似度較高的原因。MALDI-TOF MS技術(shù)是基于蛋白質(zhì)水平對(duì)菌株鑒定分析，對(duì)不同菌株間同源性分析迅速,為判斷是否發(fā)生院內(nèi)感染提供依據(jù)。但其檢測(cè)受多種因素影響，目前利用MALDI-TOF MS進(jìn)行同源性分析仍屬于研究階段。脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型通過(guò)檢測(cè)染色體上所有酶切位點(diǎn)的變化反映全部基因的相關(guān)性，被認(rèn)為是基因分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究中利用MALDI-TOF MS同源性分析后期仍需要PFGE分型驗(yàn)證，以便進(jìn)一步探討MALDI-TOF MS技術(shù)在細(xì)菌同源性分析中的價(jià)值。