水凝膠對腹腔開放下小腸氧化應激的保護作用

周 翔，趙澤玉，郭正昌，李大路，張宗耀，周 波，常家聰

在過去20年，腹腔開放療法(open abdomen technique)挽救了大量創傷及外科危重患者，已成為救治腹部創傷、復雜腹腔感染和重癥壞死性胰腺炎合并腹腔間隔室綜合征的重要手段。腹腔開放后，腹腔內腸管暴露于空氣中，會引起水、電解質及蛋白質的大量丟失，機體內穩態失衡；腹腔臟器，主要是腸管繼發性缺血再灌注損傷，導致腸瘺和腹腔感染。因此，針對開放的腹腔，人們采用了各種方法臨時關閉腹腔以期減少并發癥的發生以及腹壁的無限制開放。然后，這些暫時性關腹措施，不論是早期的滌綸布和聚丙烯網片，還是目前常用的Wittmann補片和負壓封閉引流，都存在著共同的問題：無法有效保護腹腔內臟器。本課題組前期制備了殼聚糖-聚乙二醇-酪胺水凝膠，其具有良好的生物相容性和生物黏附性，可以保護腸管和促進創面愈合。因其可以原位快速成膠，封閉開放的腹腔，所以該研究旨在探討水凝膠是否能保護腸管氧化應激。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

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實驗動物 6月齡健康SD雄性大鼠60只，體質量230～280 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，標準飼養條件下喂養。

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主要試劑 硫代巴比妥酸(TBA, T5500MSDS)購自美國Sigma-Aldrich LLC公司。乙酸和檸檬酸為優級純，乙酸鈉為色譜級，均為天津市科密歐化學試劑開發中心產品。氫氧化鈉為北京益利精細化學品有限公司產品。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na)為分析純，美國JTBaker公司產品。甲醇為色譜純，北京DIKMA公司產品。丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、磷酸二氫鉀、對硝基苯氯甲酸酯、聚乙二醇、酪胺、殼聚糖、辣根過氧化物酶和雙氧水購自北京碧云天生物技術公司。

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主要儀器 全波長酶標儀、高效液相色譜儀系統(美國賽默飛公司)，低溫高速離心機(上海菲恰爾公司)，美國Agilent真空固相萃取裝置和美國Varian BondElutC18(500mg)固相萃取小柱。

1.2 方法

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動物模型制備 采用如下方法建立大鼠腹腔間隔室綜合征模型：手術區域常規備皮、消毒和鋪巾，取腹部正中切口，結扎遠端盲腸，用18G針穿破結扎盲腸壁，擠出少許糞便關腹。腹部正中右側1 cm處穿刺置入一2 mm導管，將氮氣注入大鼠腹腔并維持3.325 kPa腹內壓4 h。隨后將大鼠分為3組：殼聚糖-聚乙二醇-酪胺分子水凝膠組(CPT組)、暫時性關腹組(TAC組)、假手術組(Sham組)。CPT組：大鼠腹腔開放后，將殼聚糖-聚乙二醇-酪胺分子水凝膠貼合裸露腸壁，后用聚丙烯網片臨時關腹；TAC組：腹腔開放后，隨即用聚丙烯網片縫合關閉腹腔，適時對網片表面滴加生理鹽水；Sham組：打開腹腔后隨即關閉腹腔。

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觀察氧化應激損傷細胞 在腹腔開放后的4 h時，刮取CPT組和TAC組大鼠末端回腸黏膜組織，并用熒光染料對組織進行染色，然后用熒光顯微鏡觀察，拍攝相關圖片。

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TBA法測定MDA的水平 腹腔開放后4、8、24 h，取大鼠小腸組織，勻漿器中研磨，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液，置冰上待測。配制MDA檢測工作液。取上清液加試劑在 100 ℃水浴中保溫 60 min 后(蓋緊，防止水分散失)，置于冰浴中冷卻，常溫6 300 r/min離心 10 min。 吸取 200 μl 上清液于微量玻璃比色皿或 96 孔板中，測定各樣本在 520 nm 處的吸光度值。測得CPT組、TAC組、Sham組各波長處的吸收度。通過標準曲線計算出MDA的濃度。

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ELISA法測定8-羥脫氧鳥苷(8-OHDG)的水平 腹腔開放后4、8、24 h，取大鼠小腸組織，勻漿器中研磨，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液，置冰上待測。標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μl。加樣：分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl(樣品最終稀釋度為5倍)。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加酶：每孔加入酶標試劑100 μl，空白孔除外。溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。終止：每孔加終止液50 μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)。測定：以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD)值。測定應在加終止液后15 min以內進行。根據標準曲線計算樣本8-OHDG濃度。

2 結果

2.1 水凝膠具有很好的氧化應激保護作用

為了驗證水凝膠是否可以保護腹腔開放后小腸的氧化應激狀態，采用免疫組織熒光法觀察末端回腸的氧化應激損傷細胞數量。結果顯示：腹腔開放后4 h，CPT組的氧化應激損傷細胞數量明顯少于TAC組(圖1)。

圖1 腹腔開放后4 h末端回腸的氧化應激損傷細胞數量A：CPT組；B：TAC組；A1、B1：×10；A2、B2：×20

2.2 腹腔開放后4 h三組小腸MDA和8-OHDG水平的差異

為了驗證不同組間的MDA和8-OHDG水平是否有差異，采用TBA法和ELISA法檢測腹腔開放后4 h小腸勻漿的MDA和8-OHDG水平(圖2)。結果顯示，三組MDA、8-OHDG差異均有統計學意義(MDA：

F

=6.716,

P

<0.05；8-OHDG：

F

=7.234，

P

<0.05)。LSD-

t

檢驗顯示CPT組和TAC組的MDA和8-OHDG水平均大于Sham組，差異有統計學意義(

P

<0.05)。CPT組小腸組織的MDA和8-OHDG水平均小于TAC組，差異有統計學意義(

P

<0.05)。

圖2 腹腔開放后4 h小腸組織的MDA和8-OHDG的濃度比較與Sham組比較：*P<0.05；與TAC組比較：#P<0.05

2.3 腹腔開放后不同時間點小腸MDA和8-OHDG水平的差異

為了驗證不同時間的MDA和8-OHDG水平是否有差異，采用TBA法和ELISA法檢測腹腔開放后4、8、24 h小腸勻漿MDA和8-OHDG水平(圖3)。經過方差分析和LSD-

t

檢驗，在CPT組中，腹腔開放后8、24 h小腸的MDA和8-OHDG水平明顯降低，差異有統計學意義(MDA組：

F

=8.234，

P

<0.05；8-OHDG組：

F

=4.518，

P

<0.05)。腹腔開放后8 h，小腸的MDA和8-OHDG水平恢復至假手術組水平(圖3A)。在TAC組，腹腔開放后8、24 h小腸的MDA和8-OHDG也低于4 h(

P

<0.05)，但高于CPT組和假手術組(圖3B)。

圖3 腹腔開放后不同時間點MDA和8-OHDG水平變化A：CPT組腹腔開放后4、8、24 h小腸的MDA和8-OHDG水平；B：TAC組腹腔開放后4、8、24 h小腸的MDA和8-OHDG 水平；與同一指標4 h比較：*P<0.05

3 討論

創傷、感染及腹部外科大手術均有可能導致腹壁的相對和絕對缺損，常使腹腔處于被動開放狀態。此外，在急診普通外科和血管外科，為治療腹腔感染、腹腔大血管破裂及重癥急性胰腺炎合并的腹腔間隙綜合征常需采用主動的腹腔開放。腹腔開放后，原有的生理穩態被打破，于是產生了一系列并發癥，如水電解質和蛋白質丟失、腸瘺、腹腔膿腫等。這也就要求盡早關閉開放的腹腔，恢復生理穩態。最理想的結果就是筋膜關閉或腹壁缺損修復，結構上恢復腹壁連續性，腹腔生理功能進而得以恢復。然而，再次探查、臟器水腫、腹壁回縮等眾多伴隨因素的存在，客觀上不允許早期關閉筋膜或腹壁缺損修復，這使得腹腔一直處于開放狀態。

針對開放的腹腔，采用了多種方法，即暫時性關腹措施(TAC)，臨時封閉腹腔以期可以減少腹腔開放后各種并發癥。然而，不論是早期的滌綸布和聚丙烯網片，還是目前常用的Wittmann補片和負壓封閉引流(NPWT)，因其均為生物惰性材料，都存在著共同的問題：治療時間長和腸瘺形成率高。這些問題也成為阻礙后期腹壁缺損修復或腹腔開放療法臨床應用的關鍵性技術難題。在腹腔開放早期，如何保護裸露臟器和促進創面快速修復是迫切需要解決的問題。

腹腔開放療法能夠使腹腔內的高壓環境解除，可能繼發出現腹腔內臟器缺血再灌注，或可加重臟器氧化應激損傷，那么腸管保護在這里就顯得尤為重要。為了實現這個目標，曾嘗試過多種補片如Wittmann補片、聚丙烯網片等暫時性關腹方法。因補片表面干燥、保水性差、腹膜仿生差、磨損腸壁、無法維持內環境穩定等特點，所以效果不甚理想。解決方案之一就是為開放的腹腔設計一層保護膜。這種保護膜應能最大程度仿生腹膜，恢復腹腔內環境，解決腹腔開放的五大病理生理難題：水分蒸發、通暢引流、腸道功能恢復、腸瘺形成和腹壁缺損；同時又可提供生物活性信號和支架，有利于新生血管和細胞長入。水凝膠材料由于具有良好的保水能力和“濕”、“潤”的表面環境；并且能改善關腹材料與腸壁接觸的微環境和減少腸壁磨損和損傷等特點，因此本研究選用可以原位成膠并且具有腸管黏附性的CPT水凝膠進行了研究。

免疫組織熒光圖表明相對于TAC組，CPT組具有較低的氧化應激損傷水平。缺養和氧化應激產生的線粒體呼吸爆發，呼吸爆發的直接產物就是反應性氮自由基(RNS)、氧自由基(ROS)等一系列氧相關的自由基，是能活躍結合還原性物質含有自由電子基團的氧自由基。細胞的生命組成單位包括：多糖、脂質、蛋白、水、遺傳物質、無機鹽，這里除了無機鹽、水無法被強氧化劑自由基氧化外，幾乎都是自由基攻擊的對象。由于特異性的要求，本研究選取了脂質和遺傳物質的氧化產物作為研究對象。MDA是脂質的過氧化評估指標，8-OHDG是遺傳物質的過氧化評估指標。MDA 和8-OHDG的濃度差異在量化細胞損傷中均具有統計學意義，可作為腹腔開放條件(腹腔間隙綜合征)下腸氧化應激損傷指標。因此通過測量MDA和8-OHDG濃度來觀測小腸氧化應激損傷的情況。在腹腔開放情況下，腹腔間隙綜合征解除、缺血再灌注恢復、局部微環境破壞等狀況除了會對常見的漿膜造成侵蝕外，還會進一步加重腸道氧化應激水平。課題組發現腹腔開放組(包括TAC組和CPT組)腸道內的氧化應激標志物8-OHDG和MDA氧化應激水平高于Sham組，同時在CPT組氧化應激損傷細胞更少。所以CPT水凝膠能減少腹腔開放后小腸氧化應激損傷。

水凝膠作為一種富含羥基和氨基的仿生大分子材料，具有很好的保水功能，能模仿腹膜濕潤的環境，保護腸管表面的微環境，使其能很好地進行物質交換。同時該材料能降低自由水比例，不利于細菌的生長和繁殖，有一定的抑菌作用。另外，該材料因其濕潤的接觸表面，更潤滑，不易對腸道造成損傷。該材料因其疏松多孔類似活性炭的結構，能夠開發吸附功能。水凝膠因以上優點被廣泛應用于臨床。因此，可以得出水凝膠對腹腔開放下小腸氧化應激具有保護作用。作為一種新型的生物材料，水凝膠具有良好的仿生性，可以注射，原位快速成膠，是臨床治療上極具應用潛力的生物材料。