林下藥用植物風柜斗草莖段組培快繁

游啟孫

(福建三明林業學校，福建 三明 365001)

1 引言

風柜斗草又名楮頭紅、東方肉穗草，屬于野牡丹科肉穗草屬草本植物。多生長于密林下蔭濕的地方或溪邊，是閩南地區常用的民間草藥，1989年被廈門市列入瀕危植物[1]。全草可入藥，具清肝明目的作用，治耳鳴及目霧等癥或祛肝火，尤其對急性肝炎療效最佳，對慢性肝炎及乙肝病毒攜帶者有效[2], 并用于治療肝硬化頑固性腹水及原發性肝癌[3],其功能和作用加速了風柜斗草的藥理、藥效和繁殖等方面的深入研究。但是由于野生資源過度采挖，生態環境的破壞，野生資源日益枯竭，而當前風柜斗草人工繁育主要以采集野生苗分株和扦插，成活率低且繁殖速度慢[4]，并不能滿足日益增長的市場需求，因此風柜斗草的組培快繁研究極具意義，既豐富了繁殖方式，又滿足了種苗供應。風柜斗草及相近植物相關研究有些許報道，但組培研究報道較少：李金雨等[1]對風柜草栽培技術及開發利用進行相關研究；陳向東[5]介紹林下人工種植風柜斗草的相關技術，詳細分析林下種植所帶來的市場、經濟、生態等效益；蔡坤秀等[6]應用正交試驗方法研究野牡丹科葉底紅組織培養和快速繁殖條件的優化。目前風柜斗草研究多為栽植技術和藥理方向，其組培快繁技術研究鮮有報道，本研究以風柜斗草當年生莖段為材料，建立風柜斗草組培快繁體系，為工廠化育苗提高技術支撐。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

采集野外風柜斗草并移栽于福建三明林業學校溫室大棚，取當年生莖段作為外植體材料。

2.2 試驗方法

2.2.1 外植體預處理與消毒

莖桿浸泡于含吐溫20的溶液中并清洗，流水沖洗0.5 h。75%酒精處理8～15 s，0.1%HgCl2溶液浸泡6、8、10、12、14 min，無菌水沖洗5次，切為單節莖段，接種于MS培養基中。每處理30瓶，重復3次，每瓶1根，每7 d觀察1次，30 d后統計污染率、褐化率與成活率。

2.2.2 芽誘導培養

消毒處理的單節莖段在附加6-BA(1.0、2.0與3.0)mg/L和NAA(0.1與0.5) mg/L激素配比的MS培養基中誘導，以空白MS培養基作為對照，每處理15瓶，重復3次，每瓶接種3根外植體。30 d后統計誘導率和生長情況。

2.2.3 增殖培養

將誘導不定芽轉入附加6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)和 NAA(0、0.1、0.3 mg/L)的MS培養基作雙因素完全試驗，以MS基本培養基作為對照，每處理15瓶，重復3次，每瓶接種3叢(3株/叢)。30 d后統計增殖系數和生長狀況。

2.2.4 生根培養

以MS、1/2MS、1/3MS培養基 ，IBA(0.1、0.2、0.3 mg/L)及 NAA (0、0.1、0.2 mg/L)作3因素L9(33)正交試驗，每處理20瓶，每瓶接種4株，重復3次，30d后統計生根率及根系生長。

2.2.5 煉苗及移栽

在帶遮陽網的溫室大棚中煉苗7 d，取苗洗凈培養基，在0.2%多菌靈溶液中浸根3～5 min，溫室大棚進行移栽。移栽基質為消毒過的不同配比營養土、珍珠巖和黃泥土。溫度25 ℃左右，噴霧保濕，60 d后統計成活率及生長狀況。

以上培養過程中培養基含白砂糖30 g/L，卡拉膠7 g/L，pH值6.0,生根培養添加活性炭0.1%。培養溫度(25±1) ℃，光照時間11 h/d，光照強度2000 lx。

2.3 統計分析

應用 Excel軟件和DPS v7.05進行統計分析。

3 實驗結果

3.1 消毒時間對外植體的影響

不同0.1%HgCl2消毒時間對風柜斗草莖段的影響結果見表1。每處理30瓶，重復3次，共90個外植體，試驗結果顯示：消毒時間6～14 min，外植體污染率從58.89%下降到2.22%，污染率逐漸降低；褐化率由13.33%增加到74.44%，褐化率不斷升高；消毒時間短，褐化率低但是污染率高，外植體消毒時間長，污染率低但是褐化率高，外植體成活率均較低(27.78%和23.33%)；外植體成活率隨消毒時間先提升后下降，在10min時成活率最高為65.56%。因此風柜斗草莖段俑0.1%HgCl2消毒最佳時間為10 min。

表1 消毒時間對外植體的影響

3.2 不定芽誘導

6-BA和NAA配比的雙因素完全試驗對風柜斗草莖段誘導及生長情況影響見表2。對照組誘導率為52.75%，顯著低于添加激素的組合，且全部為單芽，表明激素的添加對腋芽的誘導有顯著影響；6-BA濃度1～3 mg/L范圍內，腋芽誘導率隨濃度升高而提升，且多芽率也逐漸提高，當6-BA濃度為3 mg/L時均為多芽，但存在32%玻璃化苗，說明6-BA濃度過高；添加NAA對腋芽誘導有促進作用，濃度為0.1 mg/L相較于0.5 mg/L，誘導率和多芽率都更高，且濃度為0.5 mg/L時會出現無效愈傷，不利于誘導。試驗結果顯示處理3:MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA為最佳誘導配方，誘導率為86.46%，且87%為多芽(圖1a)。

表2 6-BA和NAA對外植體誘導的影響

3.3 不同激素配比對對風柜斗草增殖的影響

將誘導的不定芽接種到增殖培養基中做雙因素(6-BA，NAA)3水平完全試驗，9種組合處理的duncan多重比較結果表明(表3)：在對照未加激素的培養基，芽苗正常生長，但增殖系數為1.37；6-BA各濃度間增殖系數差異性顯著，濃度1.5 mg/L對叢生芽增殖影響最大，濃度2.0 mg/L和濃度1.0 mg/L次之，濃度為2.0 mg/L時出現畸形芽；NAA各濃度間差異性同樣顯著，濃度越高對增殖影響越小且芽苗質量較差，濃度為0.3 mg/L有愈傷出現；處理4的增殖系數最大為6.32，極顯著高于其他處理，且芽苗生長好、葉色正常(圖1b)。因此最佳增殖培養基為4號處理：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。

表3 不同激素配比對風柜斗草增殖的影響

3.4 生根誘導培養

取2 cm以上、生長正常的不定芽，采用3因素3水平L9正交試驗設計進行生根培養(第四列為空列)。9種組合的根數量與根長度方差分析表明，6-BA和NAA對風柜斗草生根數量和根長度影響極顯著，基本培養基對生根影響不顯著。duncan多重比較結果顯示(表4)：各處理的生根率都在100%，風柜斗草生根較容易；基本培養基(MS、1/2 MS、1/3 MS)對根數量及根長度影響不顯著，說明基本培養基對風柜斗草根的生長影響不大；濃度0.2 mg/L的IBA對根數量和根長度影響最大，與其他濃度差異性顯著，在根數量上，濃度0.3 mg/L影響次之、濃度0.1 mg/L影響最低，濃度0.3 mg/L和濃度0.1 mg/L對根長度影響不顯著；NAA各濃度對根數量和影響差異性顯著，影響程度0.1 mg/L>0.2 mg/L>0.0 mg/L，NAA各濃度在根長度影響上，濃度0.1 mg/L與其他濃度差異顯著，另外兩個濃度差異不顯著；IBA少量和NAA不添加時根生長纖細，NAA和IBA濃度高時易產生愈傷。處理2對根數量和長度影響顯著的高于其他處理，且根生長較好(粗且無愈傷，圖1c)。因此最佳生根培養基為2號處理：MS+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA。

表4 基本培養基、6-BA和NAA對風柜斗草試管苗生根的影響

3.5 試管苗煉苗與移栽

生根培養30 d后，將試管苗在溫室大棚進行煉苗7 d，前4 d緊閉瓶蓋，后3 d逐漸松蓋，洗凈培養基，0.1%多菌靈浸泡3～5 min，移栽到準備好的基質中，進行移栽試驗和duncan多重比較。從表5中看出，基質對移栽成活率有顯著差異，4號基質組合移栽成活率最高，極顯著高于其他基質組合，黃泥土越高的基質移栽成活率最低且葉色偏黃，營養土中添加少量黃泥土有助于提高移栽成活率，因此風柜斗草最佳移栽基質為營養土∶黃泥土∶珍珠巖(3∶1∶1)，移栽成活率為90.89%，植株長勢好、葉色正常(圖1f)。

表5 不同基質對風柜斗草試管苗移栽的影響

圖1 風柜斗草莖段組培各階段

4 討論

植物組培技術能有效的解決藥用植物資源短缺的問題[7]。風柜斗草作為福建閩南地區常用藥用植物，利用組培手段進行繁殖可以極大的緩和市場的需求。本研究以MS為基本培養基適合各階段試驗，MS、1/2 MS、1/3 MS用于生根試驗差異性不顯著，與前人研究表明野牡丹科植物適用于MS培養基一致[6]。

6-BA在不定芽誘導和增殖中起重要作用不同培養階段濃度不同，本研究誘導階段最適合濃度為2 mg/L,高于這個濃度時產生玻璃化，與高濃度細胞分裂素會增加黃花倒水蓮玻璃化苗一致[8]，同時附加少量NAA能有效提高誘導率。在增殖階段6-BA最適濃度為1.5 mg/L，濃度越高增殖系數反而降低，且易產生畸形芽，與樟樹莖段叢生芽增殖試驗結論一致[9].分裂素與生長素配比協調能提高叢生芽增殖系數，并提高芽苗質量[10]，本研究中1.5 mg/L 6-BA與0.1 mg/L NAA配比處理的叢生芽增殖系數極顯著的高于未添加NAA處理，且芽苗生長良好；NAA濃度提高時，增殖系數和不定芽質量均下降。

風柜斗草與同科其他植物一樣易生根，但在添加生長素處理中，根的數量、長度和質量有明顯的提高，本研究各處理生根率都在100%,添加0.2 mg/L IBA與0.1 mg/L NAA激素培養基中根的數量、長度和根質量都顯著高于其他處理，但濃度過高將影響根的生長、產生愈傷和降低根的質量，這與大麗花組培苗快繁生根試驗結論一致[11]。不同移栽基質對風柜斗草移栽成活率和植株生長有顯著影響。研究表明營養土中添加適當比例的黃泥土有助于植株生長，本研究得出最適宜基質為營養土∶黃泥土∶珍珠巖(3∶1∶1)，移栽成活率最高，植株長勢好。但過高比例影響植株生長，這與黃泥土的透氣性差、易板結等性質有關，與黃花倒水蓮移栽試驗結論一致[8]。

因此以莖段為外植體，通過誘導獲得無菌苗、不定芽增殖、生根和煉苗移栽等階段建立風柜斗草組培快繁體系，為實現工廠化育苗提供技術保障。