基于網絡藥理學與分子對接技術的平消膠囊干預結腸癌的作用機制研究

蔡孟成,張慧卿,謝 瑋,金永生

(1.海軍軍醫大學基礎醫學院,上海 200433;2.海軍軍醫大學中醫系,上海 200433;3.海軍軍醫大學藥學院有機化學教研室,上海 200433)

平消膠囊是臨床常用的抗腫瘤中成藥，廣泛用于包括結直腸癌在內的各類常見惡性腫瘤的治療，其由《金匱要略》硝石礬石散增補而來，由硝石、礬石、馬錢子、郁金、枳殼、五靈脂、干漆、仙鶴草八味中藥構成，具有活血散結、扶正解毒的功效，可緩解癌痛癥狀、縮小瘤體。近年來研究表明，我國結腸癌的發病率呈逐年上升趨勢，其發病率高居整體腫瘤的第三位，而平消膠囊對于提高患者生存質量和延長生存期起到了積極作用，且其毒副作用輕微，可長期服用[1]，但具體作用機制尚不明確。本文旨在運用網絡藥理學與分子對接技術探討平消膠囊治療結腸癌的物質基礎與作用機制，為腫瘤精準治療提供新的治療選擇，并為抗腫瘤藥物的研發提供新思路。

1 材料和方法

1.1 藥物與疾病靶點的篩選 本研究采用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP，網址http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索中藥郁金、仙鶴草、枳殼、馬錢子的活性成分；TCMSP數據庫中未收錄五靈脂、礬石、硝石、干漆四味中藥，故通過中醫藥綜合數據庫(Traditional Chinese Medicine Integrated Database,TCMID)檢索獲取收錄的四味中藥的活性成分，再利用TCMSP數據庫得到對應化合物的靶點。根據化合物口服生物利用度(oral bioavailability,OB)與類藥性(drug-likeness,DL)進行篩選，OB閾值設為OB≥30%，DL閾值設為DL≥0.18，并采用TCMSP數據庫獲得活性成分對應的靶點[2]。利用美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的醫學主題詞表(Medical Subject Headings,MeSH)檢索結腸癌(colon cancer)的主題詞，得到colonic neoplasm；再從Entry Terms選擇“colon cancer”、“cancer of colon”等疾病相關詞匯，再利用GeneCard數據庫獲取與結腸癌直接相關的靶點。檢索日期均為2020-10-22。

1.2 構建化合物-靶點網絡 為明確疾病相關靶點與平消膠囊相關靶點之間的關系，將上述兩部分靶點進行交集，輸入Cytoscape 3.6.1軟件構建化合物-靶點網絡。Cytoscape軟件的核心架構是網絡，每個節點是基因、蛋白質或分子，節點與節點之間的連接代表這些生物分子之間的相互作用，節點的度值代表網絡中節點與節點相連的數目。

1.3 構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡 為更深層次探究靶點蛋白質之間的相互作用，將統計所得的疾病-藥物靶點基因上傳至在線STRING10.5軟件(http://string db.org)，上傳時間為2020-10-24，構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡(protein-protein interaction network,PPI)模型。物種選擇為人(homosapiens)，參數保持默認設置，獲取PPI。

1.4 生物過程與通路分析 利用Cytoscape軟件中的ClueGo功能對藥物和疾病的公共靶點進行基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析，其中GO富集分析包括細胞組成(cellular component, CC)、生物過程(biological process, BP)以及分子功能(molecular function, MF)三個部分，保存結果。設定閾值P<0.05，將結果可視化。

1.5 分子對接 從蛋白質結構數據庫(Protein Data Bank, PDB，網址https://www.rcsb.org/)下載淀粉樣前體蛋白(APP)與雌激素受體1(ESR1)兩個蛋白的三維晶體結構(PDB ID為4LXM和4XI3，PDB格式)，從Pubchem數據庫(https://pub chem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載槲皮素、木犀草素和山奈酚的三維結構(CAS號為117-39-5、491-70-3和520-18-3，PDB格式)，下載時間均為2020-10-29，采用Pymol-2.4.1刪除靶蛋白的配體，然后利用AutoDock Tools 1.5.6軟件刪除靶蛋白的水分子，添加非極性氫，計算Gasteiger電荷，保存為PDBQT格式的文件。將已經保存為PDB格式的化合物導入AutoDock Tools 1.5.6，添加原子電荷，分配原子類型，所有柔性鍵均默認可旋轉，保存為PDBQT格式，作為對接配體。運行AutoGrid與AutoDock 進行對接，并利用Pymol軟件將結果可視化。

2 結 果

2.1 篩選藥物活性成分 通過TCMSP檢索到郁金、仙鶴草、枳殼、馬錢子中化合物共342個活性成分，其中222個來自郁金、17個來自枳殼、62個來自馬錢子、41個來自仙鶴草。以OB≥30%且DL≥0.18篩選出化合物38種，其中15個來自郁金、5個來自枳殼、13個來自馬錢子、5個來自仙鶴草。通過查閱TCMID數據庫獲取五靈脂中化合物共39個，干漆中化合物1個，礬石的主要成分為KAl(SO4)2·12H2O，硝石的主要成分為KNO3。將其逐個輸入TCMSP，按照上述標準進行篩選，共獲取3個化合物。去除重復化合物后共發現平消膠囊中活性物質37個，可入血的活性成分20個，并獲取對應的藥物成分靶點共113個，化合物見表1。從GeneCards數據庫中獲得21 151個與結腸癌直接相關的靶點。

2.2 化合物-靶點相互作用網絡構建 采用Cytoscape 3.6.1軟件構建的化合物-靶點相互作用網絡包含20個化合物節點、113個靶點節點和274條邊，用紅色菱形表示化合物，綠色圓形表示靶點，連接化合物與靶點的邊表示兩者之間有作用關系(見圖1)。

圖1 平消膠囊主要成分-靶點網絡圖Figure 1 Network diagram of main component-target of Pingxiao capsules

依據網絡拓撲學性質可知， 有較多節點的化合物或藥物靶點在整個網絡中可能起到關鍵的作用，因此本研究篩選節點度較大的節點進行分析。排名前5位的化合物分別為槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、川陳皮素(nobiletin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)，分別能與76、33、28、18、16和15個靶點蛋白質發生作用。從靶點的角度看，degree排名前5位的是前列腺素過氧化物合酶1(PTGS1)、核受體共活化劑2(NCOA2)、過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG)、毒蕈堿型膽堿受體 M1(CHRM1)、孕激素受體(PGR)，分別能與11、11、8、8和7個化合物發生相互作用，體現了中藥多靶點的特性。

2.3 平消膠囊靶點PPI的構建與分析 應用STRING軟件構建PPI (見圖2)，在此網絡圖中包含95個節點，948條邊，同時得到網絡中關鍵靶點的頻次。根據“度值>均值”篩選出關鍵節點40個，前20個包括APP、ESR1、EGFR、RELA、FOS、CCND1、NCOA1、MAPK8、NR3C1、IL6、AR、APOB、CASP3、CASP8、CYP1A1、NCOA2、GSK3B、PRKCA、RB1、VEGFA。度值最高的是APP和ESR1(度值為32)，其次為EGFR和RELA(度值為30)。度值大的靶點提示在網絡中起著關鍵作用，可能是平消膠囊治療結腸癌的關鍵靶點。

2.4 GO富集與通路富集分析 GO生物過程條目主要包括：核受體活性、胞內應激反應的調節、對血管內皮細胞移動的調節、胞內有機氮化合物的反應以及在凋亡過程中半胱氨酸性肽鏈內切酶的活性等。分子功能包括：乙酰膽堿受體活性、調節凋亡過程中半胱氨酸性肽鏈內切酶的活性、RNA聚合酶Ⅱ-特定DNA轉錄因子結合、蛋白激酶催化劑活性以及跨膜受體蛋白酪氨酸酶活性；并且參與了細胞膜及細胞核結構的組成。KEGG富集分析(見圖3)主要包括：腫瘤通路、糖尿病AGE-RAGE信號通路、乙型肝炎、子宮內膜癌、結直腸癌、ErbB信號通路、催乳素信號通路等通路。其中腫瘤通路占比最高(見圖4)。

圖3 平消膠囊干預結腸癌的KEGG富集分析圖Figure 3 KEGG enrichment diagram of colon cancer regulated by Pingxiao capsules

圖4 平消膠囊干預結腸癌的KEGG富集分析比例圖Figure 4 KEGG enrichment ratio diagram of colon cancer regulated by Pingxiao capsules

2.5 分子對接 一般認為配體與受體結合的構象穩定時能量越低，發生作用的可能性越大。作者對平消膠囊中的槲皮素、木犀草素和山奈酚進行分子對接，對接模式見圖5。槲皮素與 4LXM和4XI3分子對接的結合能分別為-5.10和-5.44 kJ/mol；木犀草素與4LXM和4XI3分子對接的結合能分別為-5.04和-5.58 kJ/mol；山奈酚與4LXM和4XI3分子對接的結合能分別為-5.02和-5.87 kJ/mol。結果表明，木犀草素、槲皮素和山奈酚通過與APP蛋白和ESR1蛋白結合而產生干預結腸癌的作用。

圖5 平消膠囊主要活性成分與4LXM、4XI3分子對接模式Figure 5 Molecular docking model of 4LXM and 4XI3 with main components of Pingxiao capsulesA:槲皮素與4LXM分子對接；B：槲皮素與4XI3分子對接；C：木犀草素與4LXM分子對接；D：木犀草素與4XI3分子對接；E：山奈酚與4LXM分子對接；F：山奈酚與4XI3分子對接

3 討 論

小分子靶向藥物作為新型化療藥物可通過特異性阻斷腫瘤增殖生長過程中所必需的信號轉導通路，提高抗癌療效。本研究通過網絡藥理學分析，發現槲皮素、木犀草素和山奈酚這些小分子化合物可能是平消膠囊抗結腸癌的主要化學成分。現代研究表明，槲皮素與靶向藥物一起使用可以避免靶向藥物產生耐藥性[3]，且能夠增強靶向藥物的療效，其機制可能是槲皮素通過抗氧化而抑制結腸癌細胞增殖[4]。木犀草素也具有促進結腸癌細胞凋亡的作用，其與ERK/FOXO3a依賴機制有關[5]。山奈酚則可能是通過抗氧化以及細胞毒發揮抗癌作用[6]。綜上，三種活性成分都有促進癌細胞凋亡的作用，為今后平消膠囊聯合靶向治療增效減毒、改善耐藥等方面提供新的思路。

PPI結果顯示，APP與ESR1是平消膠囊治療結腸癌的關鍵蛋白。陳霄等[7]研究表明，APP在結腸癌組織中高表達，并與結腸癌患者的預后呈負相關，提示APP可能是結腸癌患者預后的重要參考指標。GIROUX等[8]研究表明，對于自發性結腸腺瘤，清除ESR能夠使腺瘤體積顯著增加。在相同模型中，ESR再表達能顯著下調有致瘤作用的miR-17-92及miR-200a/b的出現[9]，再次印證了蛋白質相互作用網絡的結果。分子對接結果表明，平消膠囊的主要化學成分槲皮素、木犀草素、山奈酚對于兩個關鍵蛋白質——APP和ESR1均有一定的結合能力，也為這三個活性成分能夠治療結腸癌提供了依據。GO和KEGG富集分析表明，平消膠囊抗結腸癌的機制主要與細胞凋亡有關。此外，其還能夠調控乙酰膽堿活性，可以緩解癌痛癥狀；其涉及的信號通路以腫瘤信號通路為主，這也提示了平消膠囊不僅針對結腸癌，對于乳腺癌、甲狀腺癌等也有一定作用。

由于硝石、礬石為礦物類藥物，干漆為樹脂類藥物，均沒有納入網絡藥理學分析的范圍。硝石中Cu、Ba、Na、Se、Ca是抗腫瘤作用的主要無機成分。Cr、Ca、Al、K是礬石能夠抑制宮頸癌細胞生長的藥效物質基礎，作者推測這四種元素也是抑制結腸癌細胞生長的物質基礎。KIM等[10]的研究表明，干漆中紫鉚花素、非瑟酮以及硫磺菊素等6個活性成分具有抗增殖作用，這些可能是干漆抗結腸癌的活性成分。

綜上所述，平消膠囊治療結腸癌的有效成分可能是槲皮素、木犀草素、山奈酚等，這些成分可能是通過作用于APP以及ESR1蛋白調節腫瘤通路從而發揮促進細胞凋亡的作用。其中，槲皮素與靶向藥物聯合應用可避免靶向藥物耐藥性，今后可能針對具體的靶向藥物深入開展機制研究，并有望成為中藥有效成分單體用于結腸癌治療的新研究方向。根據臨床療效并結合生物信息學技術闡明藥物活性成分與疾病靶點的對應關系的方法，可以為中醫藥精準治療結腸癌提供更好的理論依據和具體方向。