維甲酸受體反應(yīng)蛋白2活化NLRP3炎癥小體在慢性阻塞性肺疾病炎性損傷中的作用機制研究*

楊文俊， 肖迎港， 張 揚， 陸大浩， 李華玲， 高 巨△

（1揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院附屬蘇北人民醫(yī)院麻醉科，2揚州大學(xué)，江蘇揚州 225001）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以氣流受限為特征的肺部疾病，氣流受限不完全可逆，呈進行性發(fā)展。COPD 的炎性損傷涉及肺部及其他肺外器官［1］。近年來全球范圍內(nèi)的COPD 發(fā)病率與死亡率都急劇上升，預(yù)計到2030 年，COPD 將成為世界第三大死因和第五大致殘原因［2］。維甲酸受體反應(yīng)蛋白2（retinoic acid receptor responder 2，RARRES2）是與肺、皮膚和心血管等多個器官炎癥和免疫代謝疾病的發(fā)生息息相關(guān)的脂肪因子之一［3］。目前已有研究證明，RARRES2 在COPD 發(fā)展中表達異常，可能與COPD發(fā)展中的炎性損傷有關(guān)［4］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）是參與炎癥反應(yīng)的重要蛋白，可能在COPD 炎性損傷中的發(fā)揮重要作用［5］。然而目前對RARRES2在COPD 中NLRP3炎癥小體的作用知之甚少。本研究旨在探尋RARRES2 在COPD 小鼠中的作用以及RARRES2 是否通過NLRP3炎癥小體調(diào)控COPD的炎性損傷。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

SPF 級野生型雌性C57BL/6J 小鼠32 只，10～12周齡，體質(zhì)量（18±2）g，由揚州大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號為SYXK（蘇）2017-0044。

2 主要試劑與儀器

RARRES2-siRNA 及陰性對照（negeative control，NC）siRNA（Cohesion）；小鼠白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 ELISA 試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；RARRES2 抗體（Abcam）；NLRP3、caspase-1、IL-1和IL-18抗體（中國武漢賽維爾生物科技有限公司）；大前門香煙（焦油10 mg，煙堿0.8 mg，CO 12 mg）。自制煙熏有機玻璃艙（規(guī)格40 cm×30 cm×16 cm）。實驗中RARRES2-siRNA 及NC siRNA分別溶解于不含RNA 的無菌水中，與適量陽離子脂質(zhì)體（Lipofectamine）于室溫下溫育30 min 以形成siRNA-Lipofectamine 復(fù)合體（10 g/L），以用于小鼠尾靜脈注射。

3 實驗方法

3.1 COPD 小鼠模型的構(gòu)建 將入選的野生型C57BL/6J 小鼠隨機分成4 組（n=8）：空白對照小鼠組（control 組）、COPD 小鼠組（COPD 組）、注射NC siRNA 的COPD 小鼠組（COPD+NC 組）和注射RARRES2-siRNA 的COPD 小鼠組（COPD+siRNA組），所有動物飼養(yǎng)和處置過程均符合規(guī)范。參考Demoor等［4］的方法，我們采用香煙煙霧煙熏小鼠的方法進行COPD 造模。除control 組小鼠外，其余3 組小鼠均全身暴露在3 支香煙的煙霧中，每天3 次，間隔30 min，每周進行7次煙熏，共持續(xù)12周。COPD+NC組和COPD+RARRES2-siRNA 組每周從尾靜脈注射相應(yīng)siRNA（2.5 mg/kg）。最后一次煙熏后24 h取材。

3.2 HE 染色觀察肺組織病例形態(tài)學(xué)改變 12周動物稱重后斷頸處死。取左肺下葉肺用甲醛固定24 h后，進行脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色，顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

3.3 血氣分析 3 組小鼠取動脈血樣本0.2 mL 進行血氣分析，以檢測氧分壓（PaO2）、二氧化碳分壓（PaCO2）和pH，并計算氧合指數(shù)（oxygenation index）。

3.4 血漿及支氣管肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）細胞因子測定 動物斷頸取血后，使用烘干的肝素管或有少量液體的肝素抗凝管，將得到的全血與抗凝劑充分混勻，經(jīng)過1 006.2×g離心15 min 分離出血漿樣本。結(jié)扎左支氣管以阻斷左肺，用0.5 mL 對右肺進行單肺灌洗，重復(fù)抽吸3 次，獲得BALF。按照ELISA 試劑盒說明書，檢測小鼠BALF和血漿中IL-18和IL-1β的表達情況。

3.5 肺濕/干重比的測定 所有小鼠肺灌洗結(jié)束后，取左肺上葉肺組織，稱其濕重后置于80 ℃烘箱烘烤24 h后稱其干重，計算濕重/干重比值。

3.6 免疫組織化學(xué)染色 4 μm 的組織切片抗原修復(fù)后放入3%雙氧水中孵育25 min，加入抗NLRP3、抗IL-1β 和抗caspase-1 抗體在4 ℃孵育過夜。然后用磷酸鹽緩沖液洗滌切片，在37 ℃的Ⅱ抗中孵育30 min，用DAB顯色，蘇木素復(fù)染細胞核，脫水封片。使用ImageJ軟件對其進行分析。

3.7 RARRES2、NLRP3、IL-1β 和caspase-1 的蛋白含量分析 制備肺勻漿組織并靜置30 min，于4 ℃、25 155×g離心15 min 得到蛋白溶液，將蛋白質(zhì)樣品（60 μg）電泳并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在用5%脫脂牛奶封閉后，將膜與抗RARRES2、抗NLRP3、抗IL-1β 和抗caspase-1 抗體在4 ℃下孵育過夜。隨后，用PBS洗滌3次后，將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)Ⅱ抗在室溫下孵育2 h，酶法顯色掃描。用ImageJ 圖像分析系統(tǒng)進行分析對蛋白條帶進行定量分析。以目的蛋白條帶灰度值與GRAPH 帶灰度值的比值，計算上述蛋白的相對表達量

3.8 RT-qPCR 取適量肺組織，利用Trizol 法提取組織中的總RNA，測定濃度后按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR-Green I Real-Time PCR Kit 進行PCR。GAPDH 的上游引物序列為5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，下游引物序列為5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'；RARRES2的上游引物序列為5'-GTCCACTGCCCATAGAGAC-3'，下游引物序列為5'-CCAGGGAAGTAGAAGCTGTGG-3'。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0 和GraphPad Prism 8.0 進行統(tǒng)計分析和作圖。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 敲減RARRES2 對COPD 小鼠血氣分析和肺濕/干重比的影響

與control 組比較，COPD 組肺濕/干重比顯著增加（P＜0.05），氧合指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與COPD組相比，COPD+NC組肺濕/干重比和氧合指數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），COPD+siRNA 組小鼠肺濕/干重比顯著下降（P＜0.05），氧合指數(shù)顯著增加（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Comparison of lung wet/dry weight ratio（A）and oxygenation index（B）of the mice in each group. Mean±SD.n=8.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs COPD group.圖1 各組小鼠肺濕/干重比和氧合指數(shù)

2 敲減RARRES2對COPD小鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)的改變

鏡下可見control 組小鼠肺組織完整，未見明顯的肺泡水腫及結(jié)構(gòu)破壞，未見炎癥細胞浸潤，平滑肌層和支氣管管壁未見異常（圖2A）；COPD 組和COPD+NC 組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡不規(guī)則擴大，小氣道和肺血管大量炎癥細胞浸潤，平滑肌層增厚，支氣管管壁上皮增生（圖2B、C）；COPD+siRNA 組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，小氣道和肺血管少量炎癥細胞浸潤，平滑肌層和支氣管皮偶見異常（圖2D）。

Figure 2. Histopathological observation（HE staining，scale bar=20 μm）. A：control group；B：COPD group；C：COPD+NC group；D：COPD+siRNA group. The lung tissue of mice in control group was intact and there was no obvious alveolar edema and structural damage. The structure of alveoli in COPD group and COPD+NC group was disordered，the alveoli were enlarged irregularly，and a large number of inflammatory cells infiltrated in small airway and pulmonary vessels. These pathological changes were attenuated in COPD+siRNA group.圖2 各組小鼠肺組織HE染色

3 吸煙小鼠肺組織內(nèi)RARRES2表達增高

與control 組相比較，COPD 組小鼠肺內(nèi)RARRES2 表達顯著增高（P＜0.05）；與COPD 組相比較，COPD+NC 組RARRES2表達水平無顯著差異（P＞0.05），COPD+siRNA 組RARRES2 表達水平顯著下降（P＜0.05），見圖3。

Figure 3. The protein（A）and mRNA（B）expression levels of RARRES2 in lung tissues of the mice in each group. Mean±SD.n=8.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs COPD group.圖3 各組小鼠肺組織中RARRES2表達

4 敲減RARRES2 對小鼠肺組織NLRP3、IL-1β 和caspase-1表達影響

Western blot 分析顯示，與control 組比較，COPD組小鼠肺組織NLRP3、caspase-1 p20 和IL-1β 表達均顯著增高（P＜0.05）；與COPD 組比較，COPD+NC 組小鼠肺組織NLRP3、caspase-1 p20 和IL-1β 表達水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），COPD+siRNA 組小鼠肺組織NLRP3、caspase-1 p20 和IL-1β 表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖4A。免疫組織化學(xué)染色分析也提示相似結(jié)果，見圖4B。

Figure 4. The protein expression of NLRP3，IL-1β and caspase-1 in lung tissues of the mice in each group. A：the protein expression of NLRP3，IL-1β and caspase-1 was detected by Western blot；B：immunohistochemical staining of NLRP3，caspase-1 and IL-1β（scale bar=50 μm）. Mean±SD.n=8.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs COPD group.圖4 各組小鼠肺組織中NLRP3、IL-1β和caspase-1的表達

5 敲減RARRES2 對小鼠BALF 和血漿中細胞因子的影響

與control 組比較，COPD 組小鼠BALF 和血漿中IL-1β 和IL-18 表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與COPD 組比較，COPD+NC 組小鼠BALF 和血漿中IL-1β 和IL-18 表達水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），COPD+siRNA 組小鼠BALF 和血漿中IL-1β 和IL-18表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖5。

Figure 5. The expression levels of IL-1β in plasma（A）and BALF（B），and IL-18 in plasma（C）and BALF（D）of the mice in each group. Mean±SD.n=8.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs COPD group.圖5 各組小鼠血漿和BALF中細胞因子的表達

討論

COPD 疾病發(fā)病機制十分復(fù)雜，而氣道長期慢性炎癥與疾病發(fā)生發(fā)展進程密切相關(guān)［6］。近年來，隨著對炎癥小體的進一步研究，炎癥小體所介導(dǎo)的慢性炎癥在COPD 疾病發(fā)生發(fā)展中的作用愈發(fā)受到關(guān)注。目前COPD 疾病條件下調(diào)控炎癥小體的關(guān)鍵上游分子尚知之甚少。因此本研究參考Demoor 等［4］的方法，建立香煙煙霧煙熏COPD 小鼠模型，觀察RARRES2 通過調(diào)控NLRP3 炎癥小體參與COPD 疾病發(fā)生發(fā)展。在本研究中，我們觀察到COPD 組小鼠的肺組織病理學(xué)損傷、濕干重比比值的增加、動脈血氧合指數(shù)的下降，提示動物造模成功。

RARRES2 屬于趨化素家族一員，在炎癥條件下RARRES2 前體可通過絲氨酸蛋白酶及蛋白水解酶的裂解，去除羧基末端最后6 或7 個抑制性氨基酸，最終轉(zhuǎn)化為具有完全活性的RARRES2，并與其受體共表達于特異性免疫細胞，并參與炎癥調(diào)控［7］。本研究表明，在COPD 小鼠肺組織中RARRES2 表達顯著上調(diào)，通過持續(xù)尾靜脈注射RARRES2-siRNA 敲減RARRES2表達，COPD 小鼠肺組織損傷程度及炎癥反應(yīng)水平均明顯減輕，提示RARRES2 可能在COPD疾病中發(fā)揮重要作用。與之類似的是，柴油廢棄顆粒物誘導(dǎo)［8］和香煙煙霧誘導(dǎo)［4］急性肺炎小鼠模型中RARRES2 被中性粒細胞所活化募集了更多的炎癥細胞作用于血管內(nèi)皮細胞以影響血管重塑［9］，同時還促進了抗原呈遞細胞和更多中性粒細胞從而加重炎性損傷［10-11］。

NLRP3 炎癥小體由NLRP3、caspase-1 和含胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白組成，它通過調(diào)節(jié)促炎細胞因子，如IL-1β 等的成熟和分泌，有效地調(diào)節(jié)機體天然免疫功能［12］。而NLRP3炎癥小體的異常活化則與糖尿病［13］、COPD［14-15］等疾病的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。與之相一致，本研究表明NLRP3 炎癥小體在COPD 小鼠肺組織內(nèi)異常活化，促進炎癥因子IL-1β 和IL-18 的高表達，我們通過敲減RARRES2表達可以抑制NLRP3 炎癥小體的活化，提示RARRES2 可能是NLRP3 炎癥小體關(guān)鍵的上游調(diào)控因子。既往研究中RARRES2 被認為參與在非酒精性脂肪性肝病小鼠模型［16］和肢體缺血/再灌注急性肺損傷大鼠模型［17］中Kupffer 細胞中NLRP3 炎癥小體的激活。與既往研究相似，本研究表明COPD小鼠的肺組織中NLRP3 炎癥小體表達增加，在RARRES2 低表達小鼠組中NLRP3 炎癥小體表達下降，同時NLRP3 炎癥小體下游通路IL-18 和IL-1β［18］的肺內(nèi)外過度表達被抑制。本實驗結(jié)果提示，RARRES2 不僅在肺內(nèi)激活NLRP3 炎癥小體促進COPD 小鼠肺部的炎性損傷，對肺外的炎癥同樣有促進作用；因此我們推測RARRES2對肺內(nèi)的NLRP3炎癥小體的激活使其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，激活下游炎癥因子高表達，而炎癥因子在氣道高表達的同時外溢進入循環(huán)系統(tǒng)，激活血漿中的相關(guān)細胞因子，產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)，誘發(fā)和維持炎癥反應(yīng)，RARRES2 對肺外的炎癥因子的激活也許是COPD 中系統(tǒng)性炎癥長期存在的原因。

綜上所述，本實驗對RARRES2介導(dǎo)NLRP3炎癥小體在COPD 小鼠炎性損傷中的作用進行了初步探討，研究表明RARRES2基因敲減可減輕COPD 小鼠的肺部損傷，減少肺內(nèi)外炎癥因子表達，從而減輕COPD 小鼠炎性損傷，其機制可能與抑制NLRP3 炎癥小體表達，從而降低IL-1β 和IL-18 等炎癥因子水平有關(guān)。