miR-21通過下調PPAR-α參與脂質代謝紊亂并促進糖尿病大鼠腎組織及腎小管上皮細胞纖維化病變*

向珈誼， 張會芳， 梁露群， 周星丞， 王 丹， 毛彥穩(wěn)， 張小歡， 王圓圓， 郭 兵

（貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理生理教研室，貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室，貴州貴陽550025）

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病（diabetic mellitus，DM）嚴重的并發(fā)癥之一，是導致慢性腎衰竭的重要原因。在DKD 進展至慢性腎衰竭的過程中，表現(xiàn)出腎小球濾過率下降，尿白蛋白排泄率增加，系膜細胞增生，腎小球硬化及腎小管間質纖維化［1］，其中代謝紊亂在腎小管間質纖維化的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用。除典型糖代謝紊亂外，脂代謝紊亂也影響著腎纖維化的進展［2］。導致腎纖維化的機制是復雜的，包括炎癥反應、氧化應激、腎臟近端小管細胞的凋亡、肌成纖維細胞的活化和細胞外基質的合成等［3］。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是高度保守的非編碼小RNA，通過與靶轉錄物上的互補位點結合，在轉錄后調節(jié)基因表達水平，這使得miRNAs成為許多細胞過程的重要調節(jié)因子，如能量穩(wěn)態(tài)、脂質代謝和胰腺細胞發(fā)育，脂肪生成等。近年來，體內和體外實驗研究均表明miRNAs 在調節(jié)脂質代謝中起著至關重要的作用［4］。有文獻報道，miR-21 通過促進脂蛋白的形成參與冠狀動脈的粥樣硬化過程［5］。在腎臟中的過度表達miR-21 會導致大鼠腎小管上皮細胞增殖，促進腎臟纖維化的發(fā)生［6］。提示miR-21 的失調可能通過影響代謝途徑參與DKD 的發(fā)生發(fā)展。作為脂質代謝的關鍵調控因子過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome prolifer ator-activated receptors-α，PPAR-α），對氧化應激、抗炎和減緩凋亡發(fā)展等具有重要的調控作用。特異性PPAR-α 激動劑非諾貝特已被用于臨床治療減少脂毒性介導的細胞損傷［7］，我們前期研究表明miR-21 可以促進糖尿病腎病的進展［6］，但miR-21 是否作用于PPAR-α 影響脂質代謝紊亂，并且是否與DKD 的發(fā)生和發(fā)展有關，目前并不清楚。因此，本研究旨在探索在DKD 大鼠病程發(fā)展中miR-21及PPAR-α的表達變化與腎纖維化的可能關系。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與細胞

6 周齡清潔級雄性SD 大鼠12 只，體質量（180±20）g，購自遼寧長生生物技術有限公司，生產許可證號為SCXK（遼）2015-0001；大鼠腎小管上皮細胞株NRK-52E 購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；人腎皮質近曲小管上皮細胞HK-2 購自中國科學院昆明細胞庫。

2 主要試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自Sigma；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM 正常糖培養(yǎng)液（葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）、DMEM 高糖培養(yǎng)液（葡萄糖濃度為30.0 mmol/L）和胰蛋白酶購自Gibco；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、Ⅰ抗稀釋液和超敏ECL 化學發(fā)光顯示劑（Beyotime）；過硫酸銨（ammonium persulphate，APS）為Boster 產品；0.45 μm PVDF膜（Millipore）；Tween-20（Solarbio）；iQTM SYBR～Green Supermix（Bio-Rad）；Lipofectamine 2000（Thermo）；miR-21 inhibitor 和miR-21 mimics（RiboBio）；非諾貝特（ApexBio）；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和β-actin 抗體（Solarbio）；轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和PPAR-α 抗體（Abcam）；纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）和Bax 抗體為Proteintech 產品；IL-18 ELISA 試劑盒（Elabscience）；Annexin V-EGFP 細胞凋亡檢測試劑盒（KeyGEN）；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（Beyotime）。

3 主要方法

3.1 糖尿病大鼠模型的復制和分組 將12只SD大鼠隨機分為DM 組和正常對照（normal control，NC）組。適應性喂養(yǎng)1 周后，DM 組大鼠進行模型復制：乙醚麻醉后通過尾靜脈給大鼠注射55 mg/kg 的STZ（STZ 用0.01 mmol/L、pH 為4.5 的無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解），72 h 后測尾靜脈空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L，持續(xù)3 d 即為造模成功［1］。各組大鼠予普通飼料繼續(xù)喂養(yǎng)，自由飲水，于成模10 周末處死。

3.2 收集大鼠尿、血和腎組織樣本 成模10 周末收集大鼠24 h尿液并記錄尿量；通過股動脈取血，靜置后離心取血清，置于-80 ℃保存；取雙側腎臟，去除包膜及脂肪。用40 g/L 的多聚甲醛溶液將一側腎臟固定，剩余的腎臟保存在-80 ℃。

3.3 生化檢測 大鼠血糖用葡萄糖氧化酶法檢測，血總膽固醇和甘油三酯用酶分析法檢測，尿蛋白濃度用雙縮脲法檢測，具體操作步驟按試劑盒進行，其中24 h尿蛋白量=尿蛋白濃度×24 h尿量。

3.4 腎組織形態(tài)學的觀察 用4%中性甲醛固定的腎臟組織制作成厚度約3 μm 的石蠟切片，用于HE和天狼星紅染色，鏡下觀察腎組織形態(tài)學結構和纖維化病變的情況。天狼星紅染色后膠原纖維呈紅色，200 倍鏡下隨機選取10 個帶腎小球的視野用Image J分析軟件測量膠原紅色陽性染色面積占組織總面積的百分比，即膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF），取其平均值作為該腎組織的CVF。

3.5 細胞轉染與分組 大鼠腎小管上皮細胞株NRK-52E 在37 ℃及5% CO2條件下進行培養(yǎng)。待細胞生長融合度達80%時，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，1 mL 無菌PBS 洗滌3 次，棄上清液并吸干，加入1 mL胰蛋白酶（濃度為0.25%，37 ℃預熱）進行消化，細胞懸液均勻鋪于6 孔板中。隨機將細胞分為正常糖（normal glucose，NG）組、高糖組（high glucose，HG）組、空載體組（HG+vehicle）組、miR-21 抑制劑組（HG+miR-21 inhibitor 組），正常糖濃度為5.5 mmol/L葡萄糖，高糖濃度為30 mmol/L 葡萄糖；各組細胞于培養(yǎng)箱中孵育過夜；待細胞融合至50%～60%時，進行轉染。轉染液配制：Lipofectamine 2000 和miR-21 inhibitor 各7.5 μL，再加入DMEM 培養(yǎng)液（不含血清及雙抗）285 μL 混勻、瞬離，在室溫下于無菌環(huán)境靜置10 min，最后加入DMEM 培養(yǎng)液2.7 mL 混勻為總體系3 mL 轉染液；棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入已經混勻好的轉染液，輕晃搖勻，繼續(xù)于培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）中孵育48 h后收集細胞進行后續(xù)檢測。

3.6 Western blot 檢測目的蛋白 稱取約60～100 mg 腎皮質置于冰預冷的勻漿器內，加入0.5～1 mL蛋白裂解液充分裂解后冰上研磨。超聲擊打組織液，1 616×g離心10 min，將上清轉移至一個新的EP管中；各組細胞進行相應處理后，加入細胞裂解液后刮取細胞提取總蛋白。BCA 試劑盒測定蛋白濃度，加入1.5×上樣緩沖液配制成統(tǒng)一濃度的蛋白樣品，100 ℃煮沸10 min。蛋白經SDS-PAGE 分離后，轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，TBST洗膜，分別加入PPAR-α（1∶1 000）、Bax（1∶5 000）、IL-6（1∶2 000）、TGF-β1（1∶1 000）、α-SMA（1∶200）、βactin（1∶10 000）和FN（1∶1 000）的Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜，TBS 洗膜后加入相應Ⅱ抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次后ECL 顯影，凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDoc，Bio-Rad）掃描條帶并分析結果。

3.7 ELISA 檢測IL-18 水平 IL-18 試劑盒購自Elabscience，產品型號為E-EL-R0567c，操作步驟完全按照試劑盒說明書進行。

3.8 Real-time PCR 方法檢測miR-21 和PPAR-α mRNA 表達 采用Trizol 法分離純化各組組織的總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA 含量及濃度。由RiboBio 公司設計并合成miR-21 引物，并用RiboBio 試劑盒進行反轉錄，步驟及反應體系配制均按照說明書進行。擴增條件為：50°C 30 min；95°C 10 min；95 °C 2 s，60 °C 20 s，70 °C 10 s，40 個循環(huán)，70°C 10 min。Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR 分析系統(tǒng)進行檢測，分別以U6 和GADPH 為內參照，目的基因的相對含量以2－ΔΔCt表示，引物序列和退火溫度見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1. Sequences of the primers used in real-time PCR

3.9 雙螢光素酶報告基因實驗驗證miR-21 對PPAR-α 轉錄調控的作用 TargetScan 預測miR-21和PPAR-α 的3’UTR 區(qū)可能結合位點，合成包含PPAR-α 的野生型（WT-PPAR-α）或突變體（MUTPPAR-α）種子區(qū)的序列，并將其克隆到螢光素酶和海腎螢光素酶質粒中。HK-2 細胞予DMEM/F12 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細胞融合至50%～60%，分別將WT-PPAR-α、MUT-PPARα 與miR-NC、miR-21 mimics 共轉染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按照螢光素酶活性檢測試劑盒，使用多功能酶標儀（Thermo Scientific VarioskanTMLUX）先后測定螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的螢光數值，用海腎螢光素酶螢光強度作為內參照標準化后，統(tǒng)計比值數據、作圖。

3.10 流式細胞儀分析NRK-52E 予非諾貝特刺激后的細胞凋亡水平 將稀釋后的NRK-52E細胞懸液均勻鋪于6 孔板中，隨機將細胞分為NG 組、HG 組、溶劑對照組（HG+DMSO 組）和非諾貝特組（HG+Fenofibrate 組），細胞生長至60%融合時，棄上清，設3個復孔，以終濃度為10 mg/L 的非諾貝特刺激48h，棄上清，PBS 洗1 次，無EDTA 的胰酶消化細胞，加入1 mL 含2%BSA 的PBS 終止消化后，用PBS 洗2 次后收集細胞，加入試劑盒配備的試劑懸浮細胞后，分別加入Annexin V-EGFP，Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應5～15 min 進行流式細胞儀的觀察和檢測細胞凋亡水平（試劑用量按試劑說明書進行）并計算各組凋亡率。

4 統(tǒng)計學處理

所有數據用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件分析處理，各組數據經SPSS 26.0 分析后，數據用均數±標準差（mean±SD）表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 一般情況與相關生化指標改變

造模第1 周，大鼠血糖逐漸升高，部分大鼠血糖值≥16.7 mmol/L；造模第2 周時，全部模型組大鼠血糖值≥16.7 mmol/L；造模第10 周時，NC 組大鼠毛發(fā)光亮，飲食飲水正常，與NC 組比較，DM 組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、尿量增多。與NC 組相比，DM 組大鼠血糖、24 h 尿蛋白、總膽固醇和甘油三酯均有顯著增高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠部分血液生化指標比較Table 2. Comparison of renal function indexes and biochemical indexes in each group（Mean±SD.n=6）

2 HE和天狼星紅染色觀察腎組織形態(tài)學改變

HE染色顯示，NC組腎小球固有細胞未見顯著增生，基底膜未見顯著增厚，系膜區(qū)未見顯著增寬，腎小管未見顯著萎縮，上皮細胞未見顯著變性，管腔內未見顯著管型，腎間質及血管未見顯著病變；DM 組部分腎小球囊腔稍擴張，系膜細胞及基質輕度增生，基底膜未見顯著增厚，腎小管局灶節(jié)段性萎縮（萎縮面積小于10%），部分小管上皮顆粒變性，未見明顯管型，腎間質小灶性淋巴細胞浸潤。小血管壁未見顯著增厚。腎臟組織天狼星紅染色顯示，NC 組腎臟組織結構清晰完整，腎間質陽性染色（紅色）少；與NC組比較，DM 組腎臟組織結構排列紊亂，腎小球和腎小管有顯著陽性染色，CVF升高（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Histological change of kidneys in each group. A：representative images of HE staining and Sirius red staining（scale bar=50 μm）；B：collagen volume fraction（CVF）was detected. Mean±SD.n=6.*P＜0.05.圖1 各組腎組織形態(tài)學變化

3 miR-21和PPAR-α mRNA 在各組大鼠腎組織中的表達

與NC 組相比，DM 組大鼠腎組織中miR-21 顯著增多（P＜0.05）；PPAR-α mRNA 在DM 組中的表達量顯著降低（P＜0.05），見圖2。

Figure 2. The levels of miR-21（A）and PPAR-α mRNA（B）in kidney tissues from NC group and DM group. Mean±SD.n=6.*P＜0.05.圖2 miR-21和PPAR-α mRNA在NC及DM大鼠腎組織中的表達

4 PPAR-α、FN、α-SMA、TGF-β1、IL-6、Bax 和IL-18蛋白在腎組織中的表達

Western blot 結果顯示，PPAR-α 蛋白在NC 組大鼠腎皮質呈高表達，在DM 組表達較NC 組顯著減少（P＜0.05）。與NC 組相比，DM 組大鼠腎組織中FN、α-SMA、TGF-β1、IL-6 和Bax 蛋白表達增多（P＜0.05），見圖3A；ELISA 檢測結果顯示，與NC組相比，DM組IL-18的含量升高（P＜0.05），見圖3B。

Figure 3. Relative protein expression of PPAR-α，F(xiàn)N，α-SMA，TGF-β1，IL-6，Bax and IL-18 in renal tissues of each group. A：the protein levels of PPAR-α，F(xiàn)N，α-SMA，TGF-β1，IL-6 and Bax in renal tissues were detected by Western blot；B：the expression of IL-18 in renal tissues was detected by ELISA. Mean±SD.n=6.*P＜0.05.圖3 PPAR-α、FN、α-SMA、TGF-β1、IL-6、Bax和IL-18蛋白在各組腎組織的表達

5 miR-21靶向抑制PPAR-α表達

通過TargetScan 預測，分別構建含有野生型PPAR-α 3'-UTR 和突變型PPAR-α 3'-UTR 序列的螢光素酶報告基因質粒（圖4A）。雙螢光素酶報告實驗結果顯示，在HK-2 細胞中轉染野生型載體WTPPAR-α的細胞實驗中，miR-21組螢光素酶活性顯著低于miR-NC 組（P＜0.05）；轉染突變型載體MUTPPAR-α的細胞實驗中，miR-21 組螢光素酶活性與miR-NC 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4B。Western blot 結果顯示，在HK-2 細胞過表達miR-21 后，PPAR-α 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖4C。

Figure 4. PPAR-α expression was inhibited by miR-21. A：bioinformatics website TargetScan predicts that miR-21 may regulate thePPAR-α gene；B：PPAR-α luciferase activity detection results；C：down-regulation of PPAR-α protein level after miR-21 mimics transfection. Mean±SD.n=3.*P＜0.05.圖4 miR-21靶向抑制PPAR-α表達

6 miR-21 抑制劑減輕高糖條件下大鼠腎小管上皮細胞的損傷

Western blot 結果顯示，與NG 組相比，高糖刺激腎小管上皮細胞后PPAR-α 蛋白表達顯著下降，F(xiàn)N、IL-6 和Bax 蛋白表達水平均顯著增加（P＜0.05）；在HG處理并轉染miR-21抑制劑后，NRK-52E中PPARα 蛋白表達水平顯著升高，F(xiàn)N、IL-6 和Bax 蛋白表達顯著下調（P＜0.05），見圖5。

Figure 5. miR-21 inhibitor attenuated hyperglycemia-induced NRK-52E cell damage. Mean±SD.n=3.*P＜0.05；#P＜0.05.圖5 miR-21抑制劑減輕高糖條件下大鼠腎小管上皮細胞的損傷

7 非諾貝特抑制高糖對大鼠腎小管上皮細胞的損傷

流式細胞儀檢測細胞凋亡實驗結果顯示，與NG組［（4.34±0.27）%］相比，HG 刺激后細胞凋亡率［（15.29±3.07）%］顯著增高；與溶劑對照組［（14.88±4.04）%］相比，在給予PPAR-α 特異性激動劑非諾貝特后，其細胞凋亡率［（7.17±0.61）%］減少（P＜0.05），見圖6A；Western blot 結果顯示，與NG 組相比，高糖刺激腎小管上皮細胞后PPAR-α蛋白表達顯著下降，F(xiàn)N 和IL-6 蛋白表達水平均顯著增加（P＜0.05）；在HG處理并給予非諾貝特后，NRK-52E細胞PPAR-α 蛋白表達水平顯著升高，F(xiàn)N 和IL-6 蛋白表達顯著下調（P＜0.05），見圖6B。

Figure 6. Fenofibrate inhibited the damage of renal tubular epithelial cells induced by high glucose. A：flow cytometry results of NRK-52E cells in each group；B：Western blot results of PPAR-α，F(xiàn)N and IL-6 expression. Mean±SD.n=3.*P＜0.05；#P＜0.05.圖6 非諾貝特抑制高糖對大鼠腎小管上皮細胞的損傷

討論

DKD 是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，已經成為終末期腎病的首要病因，其主要病理改變特點為腎小球硬化和腎小管間質纖維化，常表現(xiàn)為上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transitio，EMT）發(fā)生和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度沉積［8］。代謝紊亂在DKD 病程的發(fā)展中有著重要的作用，長期的高血糖會引起脂蛋白脂肪酶的功能降低，導致甘油三酯水平升高，高密度脂蛋白膽固醇下降等血脂改變［9］。本研究結果顯示，與NC 組相比較，DM 組大鼠10 周末血糖、24 h 尿蛋白、總膽固醇與甘油三酯均顯著增高，生化指標結果表明DM組大鼠已發(fā)生糖、脂代謝紊亂；同時腎臟切片顯示，腎小管管腔增大，膠原纖維沉積，明確腎臟形態(tài)已經發(fā)生異常病理改變；與NC組相比，DM組中α-SMA、FN和TGFβ1 的表達增加；結合生化指標與病理形態(tài)學，說明DM大鼠腎臟發(fā)生了EMT及纖維化病變。

目前研究表明，多種miRNAs在腎細胞中有功能表達，并且在腎臟生理功能調節(jié)和腎臟相關疾病如糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要調控作用，如miR-21、miR-377 和miR-93 等［10］。其中，miR-21 可通過調控下游PTEN/AKT、TGF-β1/smad3 等幾種主要的信號通路影響DKD 的發(fā)生發(fā)展［11］。課題組前期研究結果顯示miR-21 在腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［6］，本研究結果與前述文獻結果［6，11］一致。在本研究中，糖尿病大鼠腎組織中miR-21 表達水平顯著升高、α-SMA、TGF-β1 和FN 蛋白表達增多；高糖培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細胞中抑制miR-21可降低FN 蛋白表達減緩纖維化的發(fā)展。這些結果均證實miR-21參與DKD 的發(fā)生發(fā)展，而抑制miR-21可延緩腎臟纖維化。

Ni等［12］在人類非小細胞肺癌細胞中過表達miR-21后，觀察到細胞內脂質的含量顯著增加，并且脂肪酸合酶，乙酰輔酶A羧化酶1等關鍵脂質代謝酶的水平顯著提高。PPAR-α 是過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome prolifer ator-activated receptors，PPARs）中一個重要亞型，在腎臟、肝臟和心臟等臟器中呈高度表達［13］。作為脂肪酸氧化酶基因的主要轉錄調控子，PPAR-α 能夠激活過氧化物酶體、線粒體基質中涉及脂肪酸氧化的多個基因參與維持正常的脂質代謝。因PPAR-α是與脂質代謝關系非常密切的基因，為了進一步闡明miR-21 參與脂質代謝紊亂調節(jié)糖尿病腎病大鼠的機制，我們采用real-time PCR 方法研究DM 組大鼠體內miR-21 與PPAR-α mRNA 的表達情況。結果顯示，與NC 組相比，DM 組腎組織miR-21 表達較NC 組顯著性增高，而PPAR-α mRNA 和蛋白的表達則顯著降低。并且在高糖條件下培養(yǎng)的腎小管上皮細胞中，給予miR-21 inhibitor能逆轉高糖對PPAR-α 的抑制效應。這些數據提示miR-21 可調控PPAR-α基因表達。我們通過生物信息學網站TargetScan 分析預測miR-21 的種子序列（5'-AGCUUA-'3）與人PPAR-α mRNA 的3'UTR 序列（5'-UAAGCU-3'）互補。體外螢光素酶檢測結果顯示miR-21 mimics 可顯著抑制PPAR-α 的轉錄活化，若突變PPAR-α 3'UTR 結合區(qū)域，可消除該效應；并且，給予miR-21 mimics 可下調腎小管上皮細胞PPAR-α蛋白水平，提示miR-21能夠靶向抑制PPARα 表達。因此，我們推測miR-21 通過抑制靶基因PPAR-α表達發(fā)揮其生物學作用。

在單側輸尿管梗阻的模型中，上調PPAR-α可顯著抑制促炎細胞因子/趨化因子IL-6，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的mRNA 表達［14］。在肝癌細胞中，PPAR-α 還抑制炎癥因子IL-18 的表達［15］。IL-6 和IL-18 作為重要的促炎細胞因子，可促進其他炎癥因子釋放，使血管通透性增加，致使腎小球基底膜損傷進而導致腎臟的損傷以及纖維化［16］。有文獻報道，上調PPAR-α的表達可減弱凋亡源性因子如Bax 、caspase 的水平［17］。Tanaka 等［18］研究結果顯示，PPAR-α 特異性激動劑非諾貝特可減輕高脂導致的腎小球損傷和腎小管間質的損傷，增加脂肪分解酶的表達，加強腎臟的脂解作用，減弱腎臟的氧化應激反應與炎癥反應。體內實驗中，在DM組腎組織中炎癥因子IL-6和IL-18及凋亡蛋白Bax的表達水平較NC 組顯著升高。體外實驗中，與NG 組相比，在HG環(huán)境中，IL-6、Bax和FN蛋白表達顯著升高，抑制miR-21 后上述效應反轉；給予PPAR-α 激動劑非諾貝特后，不僅顯著降低細胞凋亡率，并且可減少HG 誘導的IL-6 和FN 蛋白表達。這與抑制miR-21 的效應相同，結合上述實驗結果，我們認為miR-21可下調脂代謝關鍵因子PPAR-α促進細胞炎癥與凋亡反應，這可能是miR-21導致DKD進展的重要機制之一。

綜上所述，高糖可通過上調miR-21 抑制PPARα 表達，導致脂質代謝紊亂，進而促進腎小管上皮細胞炎癥反應及凋亡，參與糖尿病大鼠腎臟組織EMT的發(fā)生和ECM 沉積，最終影響其腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展，但具體機制仍需要進一步研究闡釋。