細胞自噬與腎臟疾病研究中國專家共識

中國病理生理學會腎臟病專業委員會； 劉華鋒， 楊俊偉

（1廣東醫科大學附屬醫院腎病研究所，廣東湛江 524001；2南京醫科大學第二附屬醫院腎臟病中心，江蘇南京 210003）

1963 年比利時生物化學家Duve 第一次使用自噬（autophagy）這一名稱，他同時因發現溶酶體獲得了1974 年的諾貝爾生理學或醫學獎。日本科學家大隅良典因發現了細胞自噬機制而榮獲2016 年諾貝爾生理學或醫學獎。目前認為細胞自噬是一種溶酶體依賴的細胞降解途徑。自噬包括生理狀態下的基礎自噬以及應激狀態下所誘導的自噬［1］，在腎臟固有細胞的生理及病理過程中均發揮重要作用。目前我國腎臟病領域的同道對細胞自噬基本理論知識的認識參差不齊，對自噬檢測方法的合理使用需進一步規范，特別是未來如何以細胞自噬為切入點開展各種腎臟疾病發病機制研究有待進一步明確。為此，中國病理生理學會腎臟病專業委員會（Chinese Association of Pathophysiology，Society of Nephrology，CAPN）組織相關專家通過查閱Medline、Biomedicine和MEDLINE Search 有關自噬文獻1 000 余篇，參考2021 年國際Guidelines for the Use and Interpretation of Assays for Monitoring Autophagy，結合中國專家在自噬領域，特別是自噬與腎臟病研究的經驗，首次制定了這部專家共識。共識介紹了自噬分類、形成機制、檢測技術及自噬失衡與各種腎臟病發病機制的關系，并總結靶向自噬通路相關分子防治腎臟疾病新進展和未來趨勢，希望為廣大從事腎臟病臨床與基礎研究的工作者提供有益參考。

1 細胞自噬分類

根據待降解的底物類型和向溶酶體運送底物的途徑，自噬可分為微自噬（microautophagy）、分子伴侶介導的自噬（chaperone-mediated autophagy）和巨自噬（macroautophagy）。前兩者直接發生在溶酶體上，不涉及雙層膜結構的自噬小體（autophagosome）。其中，微自噬是通過溶酶體膜的內陷主動、直接吞噬胞漿成分［2］；分子伴侶介導的自噬則是通過熱休克同源蛋白70（heat shock cognate protein 70，Hsc70）特異性識別含有KFERQ五肽蛋白成分，通過溶酶體相關膜蛋白2（lysosomal-associated membrane protein 2，LAMP2）和其它輔因子的多聚體將待降解的物質傳遞到溶酶體內進行降解［3］；而巨自噬需形成大小為0.5～2 μm 的雙層膜結構自噬小體［4］。巨自噬是細胞自噬中最常見的自噬類型，故一般將其簡稱為“自噬”。

另外，根據底物是否具有選擇性，細胞自噬（巨自噬）又可分為非選擇性自噬和選擇性自噬。當營養匱乏時，非選擇性自噬激活，底物隨機被包裹進自噬泡進行降解；而細胞出現特異性細胞器損傷時，則一般啟動選擇性自噬，包括線粒體自噬、溶酶體自噬、核糖體自噬、細胞核自噬及內質網自噬等［5］。選擇性自噬的分子機制各不相同，比如溶酶體嚴重損傷后膜通透性增加，其內β-半乳糖苷快速被胞漿中的半乳糖凝集素3（galectin-3；作為感應器）識別并結合，使受損的溶酶體被特異性的標識，結合到溶酶體膜上的galectin-3 招募TRIM16（tripartite motif-containing 16；作為適配器）并募集E3 泛素連接酶，促使溶酶體膜蛋白泛素化，繼而使ATG16L1（autophagyrelated 16-like 1）和ULK1（Unc-51-like kinase 1）等自噬起始因子激活，溶酶體被特異性包裹進自噬泡進而被降解［6］。因此，選擇性自噬研究重點集中在尋找特異性的感受器和適配器，以及相關調節機制。

專家推薦意見一：1. 根據待降解的底物類型和向溶酶體運送底物的途徑，推薦自噬分為微自噬、分子伴侶介導的自噬和巨自噬3 類進行相關研究。2. 根據底物是否具有選擇性，建議將細胞自噬分為非選擇性自噬和選擇性自噬進行研究。

2 關于“自噬流”

“自噬流”（autophagic flux）是指細胞自噬發生的全過程，包括起始、成核、延伸、成熟、融合和降解以及降解產物轉運至細胞質（圖1）［1］。在自噬起始階段，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶ULK1、ULK2和其它結合蛋白形成的復合體發揮重要作用［7］；而磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）復合物調節囊泡成核和自噬泡形成［8］；ATG12-ATG5-ATG16L系統和微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3；又稱LC3）系統則控制自噬囊泡擴張和最終自噬小體形成［9］。因此，在研究細胞自噬時應該特別注意“自噬流”形成過程中的不同關鍵分子，并深入開展相關機制研究。其次，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體（autolysosome）是自噬的后續階段，被自噬小體捕獲的物質被運輸到溶酶體進行降解，所產生的生物小分子通過溶酶體內特異性受體運輸至細胞漿重新利用。細胞骨架相關的運動蛋白、可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（solubleN-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE）等在調控自噬溶酶體形成過程中可能發揮重要作用［10］，但其機制還不十分清楚，因此也是一個值得研究的課題。此外，最近研究提示自噬溶酶體重構（autophagic lysosome reformation，ALR）促進溶酶體新生，但其病理生理學意義及相關機制也值得深入探討［11］。

專家推薦意見二：1. 推薦研究“自噬流”形成過程中的不同關鍵分子及相關機制。2. 建議深入探討自噬溶酶體形成及自噬溶酶體重構的機制和關鍵調控分子。

3 細胞自噬的調控

細胞自噬可響應多種因素而啟動，如活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）、內質網應激、缺氧、DNA 損傷和免疫信號等，但其活性的高低受到啟動轉錄及轉錄后蛋白修飾調控，其中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路、AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）通路、乙酰化修飾等發揮關鍵作用（圖1）。這些調控因素會激活或抑制自噬，使細胞能夠快速適應或抵抗瞬時細胞應激，以維持細胞生命活動。

Figure 1. Schematic presentation depicts the autophagic flux and main regulatory mechanisms（provided by Institute of Nephrology，Affiliated Hospital of Guangdong Medical University）. The autophagic flux is divided into initiation，nucleation，elongation，autophagosome maturation，fusion with lysosomes，and degradation of autophagic cargoes. Autophagy is regulated by transcription factors，kinases（mTOR，AMPK，etc）and post-translational modifications.圖1 自噬流的過程及主要分子調控機制（廣東醫科大學附屬醫院腎病研究所供圖）

3.1 轉錄水平調控 自噬轉錄調控是指通過促進自噬相關基因或溶酶體相關基因的表達調節細胞自噬活性，其中，針對小眼癥轉錄因子E（microphthalmia/transcription factor E，MiT/TFE）家族的轉錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）蛋白研究最為突出。已知TFEB 主要調節溶酶體生物發生、溶酶體胞吐、脂肪吞噬等。在營養豐富或非應激條件下，TFEB 處于非活性狀態；當細胞應激時，TFEB 被去磷酸化激活，發生核轉位，啟動自噬相關基因的表達，促進溶酶體新生并與自噬體融合，從而促進自噬通量。另外，核受體超家族的一些轉錄因子如Rev-Erbα/NR1D1（nuclear receptor subfamily 1，group D，member 1）以組織特異性方式調節自噬相關基因表達。如NR1D1 通過直接與DNA 序列中的調控區結合，抑制骨骼肌中Ulk1、Bnip3（Bcl-2/adenovirus E1B 19 kD-interacting protein 3）、Atg5和Becn1（beclin-1）等基因的表達［12］；而在肌肉組織中，NR1D1上調自噬相關基因表達（如Ulk1等），促進自噬。此外，叉頭框蛋白O（forkhead box protein O，FOXO）家族的轉錄因子也參與多個自噬相關基因的轉錄［13］。其次，表觀遺傳相關蛋白如乙酰轉移酶TIPO60可通過促進組蛋白H4的乙酰化誘導自噬基因表達，進而促進細胞自噬。其它如亞精胺、褪黑素、液泡膜蛋白1（vacuole membrane protein 1，VMP1）、早期生長反應蛋白1（early growth response protein 1，EGR1）等都可參與自噬相關基因的轉錄調控，從而調節自噬通量［14］。目前，上述分子在腎臟病自噬研究領域仍有較大的研究空間。

3.2 mTOR通路 mTOR是一種進化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇相關蛋白激酶家族的成員。大量研究表明，mTOR是自噬的關鍵調節因子。mTOR 參與形成2 種類型的復合物，即雷帕霉素敏感的mTOR 復合物1（mTOR complex 1，mTORC1）和不敏感的mTORC2。其中，mTORC1信號是自噬發生過程的“守門員”，它通過與下游信號分子真核翻譯起始因子4E結合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4E-BP1）、核糖體蛋白S6 激酶1（S6 kinase 1，S6K1）相互作用，啟動并調控自噬相關基因的轉錄和翻譯，參與自噬水平的調節［15］。在營養豐富時，mTORC1 通過介導ULK1（Ser637 和Ser757）和ATG13（Ser258）特定位點磷酸化，抑制ULK1 復合物的活性，從而抑制自噬小體的生物發生；而在饑餓和細胞應激時，mTORC1 活性被抑制而與ULK1 分離；游離的ULK1 通過Thr180 磷酸化而激活募集并磷酸化ATG13、FIP200（focal adhesion kinase family-interacting protein of 200 kD）、ATG101 和其他ATG 蛋白形成ULK1 復合物，隨后轉移到內質網的隔離膜上，啟動自噬［16］。mTORC1也可通過磷酸化ATG14、AMBRA1 和NRBF2（nuclear receptor binding factor 2）直接調節Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶復合物1（class Ⅲphosphatidylinositol 3-kinase complex 1，PI3KC3-C1）的活性，抑制自噬的成核步驟［17-18］。此外，mTORC1 還可以通過靶向WIPI2（WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 2）和p300 乙酰轉移酶參與調節自噬體形成的延伸步驟：如通過磷酸化p300，促進LC3 乙酰化，阻礙LC3脂化，從而抑制自噬［19］。進一步，mTORC1 磷酸化WIPI2并阻礙其與ATG16L的結合，從而抑制ATG12-ATG5-ATG16L 復合物結合到自噬體膜上，干預磷脂酰乙醇胺對LC3脂化的促進作用，最終抑制自噬［20］。

3.3 AMPK 通路 AMPK 是一種異源三聚體蛋白質激酶，也是誘導自噬的重要因素。AMPK 主要通過2種信號調控自噬：mTOR依賴和非依賴兩種方式。在細胞營養缺乏時AMPK 被激活［21］，通過抑制mTORC1 復合物的形成及活化，激活ULK1 復合物，啟動細胞自噬。AMPK 還可通過磷酸化ULK1 而直接啟動細胞自噬［22］。此外，AMPK 還可以直接介導beclin-1 的Thr388 位點磷酸化，促使beclin-1 與Bcl-2解離，促進PI3KC3-CI的形成，產生大量磷脂酰肌醇-3-磷酸（phosphatidylinositol-3-phosphate，PI3P），從而促使自噬泡生成［23］。AMPK 還可以促進ATG16 復合物的形成，募集ATG5-ATG12 催化LC3 的羧基末端甘氨酸共價連接到吞噬泡膜而形成自噬泡［24］，從而促進自噬進程。相反，在葡萄糖充足的情況下，活化的mTORC1 通過磷酸化ULK1 特定位點（Ser757）破壞ULK1 與AMPK 之間的相互作用而阻止ULK1 活化，從而抑制自噬啟動。

3.4 脫乙酰酶sirtuins（SIRTs）通路 SIRTs 是一類參與代謝調節的NAD+依賴性Ⅲ類組蛋白脫乙酰酶，包括SIRT1 到SIRT7 共7 種蛋白［25］。它們都具有高度保守的NAD+結合域和催化功能域，不同的N 端和C 端可使它們能夠結合不同的底物。SIRTs 蛋白家族調節多種蛋白的乙酰化修飾和ADP 核糖基修飾。在細胞能量耗竭的情況下，NAD+水平增加并激活下游SIRT1。SIRT1 直接介導轉錄因子FOXO1 和FOXO3的去乙酰化，所有這些都參與激活細胞自噬，以恢復細胞能量穩態［26］。SIRT1 可觸發肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）去乙酰化而激活AMPK、降低LC3乙酰化水平來激活自噬［27］。此外，SIRT1還可以通過調控關鍵自噬蛋白（beclin-1、ATG5、ATG7 和LC3）賴氨酸殘基去乙酰化作用而促進自噬，該激活是獨立于mTOR/ULK1之外的自噬調控通路［28］。

目前，上述自噬途徑蛋白及相關通路在腎臟細胞自噬中已有報道，但在不同的腎臟生理病理狀態下，其確切作用與機制仍有待深入探討，并有可能成為腎臟疾病防治的潛在靶點。

專家推薦意見三：1. 建議從基因轉錄、轉錄后蛋白修飾不同層面對腎臟細胞自噬發生的調控機制進行深入研究。2. 推薦重點探討自噬途徑相關調節分子及通路在腎臟固有細胞病理生理過程中的作用與機制。

4 細胞自噬檢測

4.1 形態學觀察 迄今為止，透射電鏡進行形態學觀察依然是自噬檢測的最直接、最經典的方法，也被認為是觀測自噬的金標準方法（圖2）［29］。但該技術只是一種靜態觀察［30］，也存在樣本制備復雜、要求觀察人員對自噬溶酶體的鑒定必須經驗豐富等一些限制因素。

Figure 2. Autophagic vacuoles identified by transmission electron microscopy（TEM）［29］. Renal biopsy specimens were detected by TEM，and autophagosome（AP）and autolysosome（AL）were marked. The scale bar=50 μm.圖2 透射電鏡下觀察到的自噬結構

4.2 自噬關鍵蛋白的檢測 ATG 是細胞自噬的重要標志蛋白。不同ATG代表自噬通路進程的不同階段。自噬激活后形成的LC3-II 水平能很好反映自噬體（包括自噬小體和自噬溶酶體）的數量。目前主要采用免疫印跡/免疫熒光技術檢測LC3-II蛋白水平和分布。表達GFP（green fluorescent protein）-LC3［31］、mRFP（monomeric red fluorescent protein）-LC3［32］等熒光重組蛋白可用于直接觀察體內外細胞自噬水平。其次，SQSTM1（sequestosome-1）/p62 是哺乳動物中首個被鑒定的自噬受體，可反映自噬過程中自噬降解情況［33］。另外，beclin-1 作為自噬起始階段的關鍵蛋白也是檢測自噬活性的關鍵指標，且有報道beclin-1-GFP 可用于觀察是否形成自噬斑點［34］。此外，一些比較重要的自噬通路蛋白復合物，如ULK1復合物［35］、ATG12-ATG5-ATG16L 復合物［9］、PIK3C3/VPS34 復合物［36］等均在細胞自噬研究中廣泛應用，可利用免疫熒光對上述復合物進行共定位觀察，也可通過免疫共沉淀檢測復合物的形成。

4.3 自噬流的檢測 自噬是一動態過程，觀察自噬流的動態過程可以了解自噬的強弱。目前最廣泛應用的是GFP-mRFP-LC3 串聯熒光蛋白［37］。在細胞中表達GFP-mRFP-LC3 后，自噬小體因有GFP 和mRFP雙熒光而顯黃色；當自噬小體進入溶酶體時，LC3 上的GFP由于溶酶體的酸性環境而淬滅，僅顯示紅色熒光。紅色熒光相對增多表明自噬活性增強；黃色熒光增多，紅色熒光相對較少則表明自噬受阻，此時即使自噬泡很多，自噬的強度也是減弱的（圖3）［38］。此外，研究者又相繼構建GFP-LC3-RFP-LC3ΔG 串聯蛋白［39］、mTagRFP-mWasabi-LC3［40］等。這些自噬標記蛋白不僅可通過顯微鏡觀察，還可利用流式細胞術等進行高通量、多參數檢測［41-42］。類似地，Rosella 生物傳感器也可作為替代方法［43］。其他檢測方法還包括：LC3 周轉（turnover）實驗，它利用野生型和G120A 突變型海腎螢光素酶-LC3融合蛋白分別對自噬降解途徑敏感和抵抗的特性，通過螢光素酶活性比值反應自噬流［44］；p62/beclin-1比值也可反應自噬流高（比值減小）低（比值增大）［45］。這些自噬流的檢測方法為我們研究腎組織細胞自噬提供了良好的工具。

Figure 3. Advanced glycation end products（AGEs）induced autophagic blockage as monitored using tandem GFPmRFP-LC3 fusion protein［38］. HK-2 cells transfected with GFP-mRFP-LC3 plasmid were treated with AGEBSA or Con-BSA for 24 h. The yellow puncta indicate autophagosomes（arrowheads），while red puncta indicate autolysosomes（arrows）. The scale bar=10 μm.圖3 GFP-mRFP-LC3 串聯熒光蛋白顯示晚期糖基化終產物阻滯自噬流

4.4 溶酶體功能的檢測 由于溶酶體是自噬通路的最終節點，溶酶體功能檢測是反映自噬活性的重要方法。目前包括：（1）透射電鏡形態學檢查；（2）內吞體（endosome）特征蛋白Rab7 和溶酶體標志物LAMP1的抗體雙標記，以檢測初級溶酶體（Rab7-/LAMP1+）和次級溶酶體（Rab7+/LAMP1+）生成；（3）溶酶體組織蛋白酶檢測；（4）LAMP 與組織蛋白酶或LC3 共標記；（5）利用DQ-卵清蛋白熒光淬滅實驗檢測溶酶體消化功能；（6）吖啶橙染色或示蹤紅檢測溶酶體酸性環境。從現有的研究結果看，很多腎臟疾病細胞自噬異常發生于自噬通路的后端，因此，溶酶體功能檢測在腎臟細胞自噬的研究中尤為重要，值得重視。

4.5 選擇性自噬的檢測 目前在腎臟疾病研究領域較多關注的是線粒體自噬和溶酶體自噬，其具體方法如下：

4.5.1 線粒體自噬檢測 包括：（1）透射電鏡及免疫電鏡觀察；（2）線粒體自噬相關標志蛋白（TOM20、VDAC、SOD2等），結合LC3-II或者LAMP1/LAMP2等進行免疫熒光、免疫組化、免疫印記等方法檢測（圖4）；（3）新近開發的mt-Keima 熒光蛋白探針，可體內外檢測線粒體自噬［46］；（4）特異性靶向線粒體的串聯熒光蛋白mCherry-GFP-FIS1［47］檢測；（5）線粒體特異性探針MitoTracker 結合溶酶體抑制劑羥氯喹也可用于檢測線粒體自噬流（mitophagic flux）［48］。

Figure 4. Chloroquine（CQ）suppressed mitophagy as detected by double immunofluorescent staining using TOM20 and LC3 antibodies（provided by Institute of Nephrology，Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，unpublished data）. HK-2 cells were treated with CQ（8 μmol/L）for 24 h. Afterwards，immunofluorescence microscopy was employed to detect the co-localization of outer mitochondrial membrane protein TOM20 and autophagosomes（LC3）. CQ inhibited lysosomal activity，thus further impairing depletion of mitochondria via mitophagy. Consequently，mitochondria were accumulated，and increased co-localization of TOM20 and LC3 was observed（arrowheads）. The scale bar=5 μm.圖4 TOM20和LC3免疫熒光染色檢測氯喹抑制線粒體自噬（廣東醫科大學附屬醫院腎病研究所提供，未發表數據）

4.5.2 溶酶體自噬檢測 檢測溶酶體自噬通常利用galectin-3 能識別受損的內吞體這一特性，構建GFP 和mRFP 串聯表達的galectin-3 熒光蛋白（tandem fluorescent-tagged galectin-3，tfGal3）來檢測溶酶體自噬，黃色斑點表示受損溶酶體［49］（圖5）。此外，也可通過免疫熒光標記galectin-3、LAMP1 和LC3 檢測溶酶體自噬［50］。

Figure 5. L-leucyl-L-leucine methyl ester（LLOMe）-induced lysophagy was detected using mRFP-GFP tandem fluorescent-tagged galectin-3（tfGal3）. HK-2 cells were transfected with tfGal3. LLOMe（200 μmol/L）was added for 1 h，prior to refreshing the culture medium. Subsequently，fluorescence was monitored at 6 h and 12 h after LLOMe washout. Yellow puncta（white arrowheads）were observed at the beginning of lysosome damage. As lysophagy processed，red fluorescence（red arrowhead）maintained，while GFP was quenched in acidic lysosomes. The scale bar=10 μm. The images were provided by Institute of Nephrology，Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，unpublished data.圖5 tfGal3檢測LLOMe導致的溶酶體自噬（廣東醫科大學附屬醫院腎病研究所提供，未發表數據）

值得注意的是，由于細胞自噬的動態性、敏感性和復雜性等，研究者必須結合多種檢測方法才能準確判斷自噬水平的高低。其中最有效的手段是前述的檢測技術聯合應用自噬流抑制劑，如wortmannin、3-甲基腺嘌呤、氯喹、巴弗洛霉素A1、亮肽素、E64d及胃蛋白酶抑制劑A 等［51］。目前它們是公認的評估自噬活性最常見和經濟的方法，值得研究者重視。

專家推薦意見四：1. 強烈推薦以透射電鏡觀察作為自噬檢測的經典方法。2. 推薦采用免疫印跡/免疫熒光技術檢測自噬關鍵蛋白表達水平。3. 推薦采用GFP-LC3 等重組蛋白動態觀察體內外細胞自噬水平。4. 溶酶體是自噬通路的終點，建議在自噬研究中檢測溶酶體功能。5. 推薦采用mt-Keima、mCherry-GFP-FIS1 等熒光蛋白研究線粒體自噬。6. 推薦采用tfGal3熒光探針檢測溶酶體自噬。

5 細胞自噬與腎臟發育、生理及衰老

5.1 自噬與腎臟發育和生理 腎臟固有細胞自噬缺陷的小鼠均能存活，且出生時腎臟結構和功能與野生型小鼠基本一樣［52］，提示細胞自噬在腎臟發育過程中并不發揮重要作用。但自噬在維持出生后小鼠的腎臟生理功能中發揮重要的作用。腎上皮細胞（SIX2 陽性）Atg5敲除的自噬缺陷小鼠，出生后2 月齡時出現白蛋白尿，至4 月齡時出現典型的局灶節段性腎小球硬化癥［53］。特異性敲除足細胞Atg5的小鼠在出生2～4 月齡時腎小球超微結構以及尿白蛋白水平均與野生型小鼠相近，并未發生明顯變化，但8～12 月齡時，敲除鼠出現足突融合和微量白蛋白尿。另外，特異性敲除腎小球內皮細胞Atg5的小鼠，出生后10 周齡時出現腎小球毛細血管輕度擴張、毛細血管袢內皮窗孔消失以及足細胞足突融合［54］，補充抗氧化劑治療，可顯著緩解腎小球內皮細胞自噬缺陷引起的腎小球病變［55］。利用他莫昔芬誘導小鼠腎小管上皮細胞時間點特異性自噬缺陷，給藥抑制小管細胞自噬體形成并引起p62 和泛素化蛋白堆積，5 個月開始出現腎功能損傷［52］。近端腎小管上皮細胞特異性自噬缺陷的小鼠在8 周齡時，尿葡萄糖和氨基酸排泌增加，提示腎小管功能出現障礙［56］。

在生理狀態下，腎臟細胞借助基礎自噬維持細胞穩態。成年腎臟固有細胞中足細胞基礎自噬水平最高，而小管系統基礎自噬水平較低［31，52］。小鼠禁食后，所有腎臟細胞自噬體和自噬溶酶體顯著增加，說明自噬是腎臟固有細胞對營養缺乏的重要保護機制。另外，腎臟細胞選擇性自噬水平和細胞總體自噬水平并不完全一致，利用mito-QC 轉基因小鼠觀察發現腎皮質近端腎小管細胞線粒體自噬活性最強，而皮髓交接部S3段腎小管上皮細胞線粒體自噬則較低［47］。

以上研究證實細胞自噬對維持生理狀態下足細胞、內皮細胞和近端腎小管上皮細胞功能非常重要。但到目前為止，細胞自噬在系膜細胞和腎小球壁層上皮細胞中的作用尚未被揭示，因此需要我們重視。

5.2 自噬與腎臟衰老 細胞衰老的特征是細胞進入不可逆的細胞周期停滯，細胞內蛋白合成、修飾或降解等異常，并出現衰老相關分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP），后者通過分泌炎癥因子和生長因子影響周圍細胞而促進臟器炎癥和纖維化，加速臟器衰老失功［57］。細胞自噬活性的降低與腎臟固有細胞衰老密切相關。抑制自噬體形成或者阻礙自噬體降解導致自噬缺陷，進而引起足細胞早衰，表現為大量受損線粒體無法清除、氧化修飾和泛素化修飾蛋白大量堆積，足細胞丟失及腎小球硬化，最終引起蛋白尿和腎功能衰竭［58］。與之類似，特異性敲除小管細胞Atg5的小鼠的小管細胞出現p62 和泛素化蛋白堆積、細胞DNA損傷、線粒體DNA損傷以及線粒體功能障礙，小管萎縮和間質纖維化等衰老表型［52］。目前細胞自噬對腎臟細胞衰老的作用機制尚未完全闡明，可能與線粒體穩態、細胞周期阻滯、細胞外基質分泌異常及炎癥小體活化等有關。此外，調節SIRT1、AMPK、mTOR及Klotho等表達，增加端粒酶活性及限制卡路里攝入均可通過維持細胞自噬平衡，減輕腎臟細胞衰老［59］。總之，隨著年齡增加，細胞自噬在衰老中的作用更為重要，進一步闡明細胞自噬對腎臟衰老的作用與機制將有重要意義。

專家推薦意見五：1. 細胞自噬在腎臟發育及維持足細胞、內皮細胞和小管上皮細胞穩態方面發揮重要作用，但在系膜細胞、腎小球壁層上皮細胞等中的作用與機制尚不十分清楚，建議加強此方面的研究。2. 細胞周期與衰老相關，細胞自噬在腎臟細胞衰老中的作用與機制尚未完全闡明，建議進一步加強細胞自噬對細胞周期和腎臟衰老的作用與機制研究。

6 細胞自噬與腎臟疾病

6.1 急性腎損傷（acute kidney injury，AKI） 在缺血再灌注引起的AKI中，近端腎小管上皮細胞自噬被激活；腎近端小管特異性敲除Atg5或Atg7基因則可加重腎缺血再灌注所引發的AKI，說明自噬激活在近端小管急性損傷過程中發揮保護作用［56］。在順鉑所致AKI 中，近端腎小管上皮細胞自噬誘導早于caspase 激活和細胞凋亡，抑制自噬加重AKI，表明自噬激活也起保護作用［60］；在膿毒血癥AKI也有類似的觀察結果［61］。此外，線粒體自噬在缺血、腎毒性物質及膿毒性血癥引起的AKI 中也被證實起保護作用。另外，AKI 除了發生小管上皮細胞變性壞死，還表現為間質炎性改變，持續的炎癥反應不但加重AKI 病情，也是AKI 向慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）轉化的促進因素。AKI 狀態下，自噬具有抑制腎間質炎癥反應的作用。其主要調節機制包括：（1）AKI 發生后機體所產生的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）可通過調節mTOR 和AMPK 通路激活自噬而抑制炎癥小體的活化；（2）自噬通過NF-κB途徑調控炎癥反應，促進損傷腎組織的修復［62］；（3）線粒體自噬減少腎小管上皮細胞NLRP3炎性小體的表達而減輕腎間質炎癥［63］。

6.2 AKI-CKD 轉化及腎臟纖維化 細胞自噬參與AKI 發生后的修復及腎臟纖維化過程（即AKI-CKD轉化）。在AKI 早期，上調腎小管上皮細胞的自噬活性有助于提高其抗損傷與修復能力，延緩AKI-CKD的轉化［64］。另外，自噬參與腎纖維化進展中的氧化應激、細胞凋亡、炎癥、成纖維細胞增殖和活化及上皮-間充質轉分化等過程。但目前細胞自噬對腎纖維化的作用仍未明確。一方面，自噬可通過維持正常溶酶體功能、線粒體自噬、細胞周期、抗凋亡［54］、抑制炎癥通路、減少促炎應激產物以及介導HIF-α/FOXO3 通路［65］等起到抗纖維化作用。另一方面，自噬通過促進受損細胞持續存活［66］、TASCC 結構形成［67］、促纖維化分子（如TGF-β 及FN）堆積［68］及激活纖維化通路［69］等起到促進腎纖維化作用。可見，細胞自噬對腎臟纖維化進程呈雙向性影響，其原因可能包括：（1）細胞自噬在纖維化中的作用廣泛；（2）自噬具有環境依賴性，在疾病的不同階段可能發揮不同作用；（3）腎臟結構復雜，不同類型細胞對自噬激活反應不一致。因此，細胞自噬對AKI-CKD 轉化及腎臟纖維化的作用與機制仍有較大的研究空間，并可能是AKI及AKI-CKD防治的新靶點［70］。

6.3 免疫相關性腎小球疾病 自噬參與免疫細胞的發育和分化并調節其功能［71］。目前研究表明，自噬在免疫相關性腎小球疾病進展中發揮重要作用。

6.3.1 IgA 腎病 在IgA 腎病患者腎活檢組織中，可見足細胞內自噬體和腫脹溶酶體累積。在IgA 腎病小鼠模型中，SIRT1/SIRT3 介導的自噬活化可抑制IgA 免疫復合物刺激下巨噬細胞NLRP3 炎癥小體的激活［72］，提示免疫細胞自噬激活可能負向調控IgA腎病的發病。另外，系膜細胞作為IgA免疫復合物沉積后受到攻擊的主要腎臟固有細胞，mTOR激活介導的自噬抑制可能是導致IgA 腎病系膜細胞增殖的主要原因［73］，而采用mTOR 抑制劑激活細胞自噬，可減輕IgA 腎病大鼠系膜細胞損傷，提示系膜細胞自噬激活可減輕系膜細胞免疫炎癥損傷。

6.3.2 膜性腎病 膜性腎病患者腎活檢組織也可見足細胞自噬體大量堆積［58］。另外，膜性腎病患者可能由于血清中分泌型磷脂酶A2 IB 組（secretory phospholipase A2 group IB，sPLA2-IB）水平升高而激活足細胞M 型磷脂酶A2 受體（M-type phospholipase A2 receptor，PLA2R）所介導的p38 MAPK/mTOR/ULK1Ser757信號通路，導致足細胞自噬發生缺陷，最終引起腎病性蛋白尿［74］。

6.3.3 足細胞病 足細胞是免疫損傷重點打擊的腎臟固有細胞之一，微小病變腎病和局灶節段性腎小球硬化癥是兩種經典的足細胞病。相比于局灶節段性腎小球硬化癥患者的足細胞，微小病變腎病患者的足細胞顯示出更高水平的自噬活性［75］。足細胞高水平的自噬活性往往預示著微小病變腎病病情穩定，不易于進展為局灶節段性腎小球硬化癥。進一步的研究證實，沉積在腎小球上皮下的補體攻膜復合物C5b-9，可刺激足細胞，使其自噬溶酶體通路阻滯，這可能是膜性腎病患者蛋白尿發生以及持續的重要原因［76］。

6.3.4 狼瘡性腎炎 在所有的免疫相關性腎小球疾病中，自噬與狼瘡性腎炎的關系研究最多。Atg5的單核苷酸多態性影響狼瘡的易感性［77］。在狼瘡發生發展過程中，多種外周血循環免疫細胞自噬水平發生顯著改變。研究發現：自噬調控狼瘡自身反應性T、B 細胞的存活，也是漿母細胞分化所必需的；自噬參與介導狼瘡患者Th17/Treg 的應答失衡［78］；腎臟巨噬細胞自噬過度活化影響狼瘡自身抗體產生和蛋白尿水平；自噬也可影響中性粒細胞外捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）的形成和釋放［79］。調控細胞自噬可再平衡免疫細胞的應答失衡，抑制炎癥反應、減輕腎臟損傷。而且，狼瘡狀態下，足細胞自噬活性被激活，且足細胞自噬活性與足細胞損傷呈負相關［80］。應用雷帕霉素增加足細胞自噬活性，可減少狼瘡自身抗體和干擾素α 誘導的足細胞凋亡及結構紊亂，說明自噬激活能對抗狼瘡所致的足細胞損傷。

綜上所述，目前自噬在免疫相關性腎小球疾病中的研究主要集中在兩個層面：一是通過對免疫系統的影響而導致免疫相關性腎小球疾病的發生和發展；另一層是足細胞、內皮細胞和系膜細胞等自噬異常對疾病進展的影響。細胞自噬活性在免疫介導的腎小球不同疾病或同一疾病不同階段的表現不同，目前也尚缺乏統一認識，需要進一步加強研究。

6.4 自噬與糖尿病腎臟疾病（diabetic kidney disease，DKD） DKD 發病機制涉及高血糖介導的血流動力學、細胞內代謝異常和細胞內應激等。其中氧化應激、內質網應激、營養過剩和缺氧等病理生理反應與細胞自噬異常關系密切［81］。足細胞在DKD 發病過程中起重要作用。DKD 早期，高糖可誘導足細胞自噬異常，抑制自噬會加速DKD 進展［54］。晚期糖基化終產物（advanced glycation end products，AGEs）抑制DKD狀態下足細胞自噬活性：AGEs一方面通過損害溶酶體功能而抑制足細胞自噬，另一方面通過激活mTORC1 信號通路，抑制TFEB 活化，進而抑制足細胞的自噬活性，降低足細胞抗損傷能力［82］。此外，氧化應激等刺激因素也可通過抑制自噬體形成，抑制足細胞自噬活性，最終導致DKD 足細胞損傷和蛋白尿形成。另外，自噬在維持近端小管上皮細胞抵抗各種原因引起的細胞損傷中起重要作用。糖尿病患者腎活檢組織中的小管上皮細胞及糖尿病小鼠小管上皮細胞均存在自噬受損，體外高糖刺激的近端小管上皮細胞自噬障礙［83］。進一步研究表明，高糖刺激的小管上皮細胞中mTOR 和Smad3 的過度激活分別抑制TFEB 活化及轉錄，造成溶酶體新生不足導致溶酶體耗竭，進而使自噬體無法通過溶酶體進行降解［38］。此外，DKD 所致的蛋白尿對腎小管上皮細胞的自噬也有影響，蛋白尿早期可促進腎小管上皮細胞自噬流，但持續大量的蛋白尿則可抑制腎小管上皮細胞自噬活性，此與損害自噬終末環節溶酶體的結構和功能相關［84］。值得注意的是，目前研究報道DKD 狀態下腎臟細胞自噬反應水平不一，但一般認為在DKD 腎臟固有細胞中普遍存在自噬不足，其作用與機制仍有待進一步查明。

專家推薦意見六：1. 自噬在AKI、AKI-CKD 轉化及腎臟纖維化過程中具有重要的調節作用，但其機制仍有較多的研究空間，建議進一步加強自噬在此領域的研究，并鑒定出新的調控分子及闡明其分子機制。2. 雖然有研究證明自噬通過對免疫細胞的影響在IgAN、膜性腎病、足細胞病、狼瘡性腎炎等免疫相關性腎小球疾病進展中發揮重要作用，或通過對腎臟固有細胞自噬的影響而介導疾病發生發展，但目前尚缺乏統一認識，推薦進一步開展相關機制研究。3.DKD 不同時期腎臟固有細胞自噬反應水平不一，建議進一步加強自噬在DKD 不同時期、不同細胞類型中的精準作用與調節機制的研究。

7 靶向細胞自噬防治腎臟疾病

7.1 靶向mTOR 信號通路的藥物 mTOR 是自噬啟動階段的關鍵調節因子，與多種腎臟疾病發生發展密切相關。雷帕霉素（rapamycin）是一種大環內酯類免疫抑制劑，同時也是最典型的mTOR 依賴性自噬誘導分子，因此，此藥除了目前的用途之外，有望開發成為治療以自噬活性抑制為特征的多種腎臟疾病的藥物，事實上，多項研究證實雷帕霉素在順鉑誘導的AKI、糖尿病腎病和多囊性腎病等實驗動物模型中具有腎臟保護作用［81］，但需要進一步臨床研究加以進一步驗證。另外，作為mTORC1/mTORC2 雙重抑制劑，Torin1 和PP242 調節自噬、保護腎臟損傷的作用也在動物實驗中得以證實［85］。但需注意的是，mTOR對自噬和細胞生長分化有反向調節作用，一方面，mTOR 抑制劑可通過激活自噬保護腎臟，但也可能抑制細胞生長而阻礙腎臟損傷后的修復過程。另外，雷帕霉素過度誘導足細胞自噬可能與腎移植后患者出現蛋白尿有關，值得注意。

7.2 AMPK 激動劑 AMPK 激活是細胞自噬誘導的關鍵環節。二甲雙胍可通過激活AMPK 而發揮自噬誘導作用、減輕AKI 時的腎小管上皮細胞損傷，且具有抗炎，抑制細胞凋亡、氧化應激、內質網應激和上皮-間充質轉化的作用［86］。另外，二甲雙胍可減輕糖尿病腎病患者足細胞丟失、系膜細胞凋亡和腎小管上皮細胞衰老，其機制也可能與調節自噬有關［87］。黃連素是一種異喹啉類生物堿，目前研究發現其可作為AMPK激活劑，通過誘導細胞自噬，抑制DKD腎小球系膜基質分泌及足細胞凋亡［88］。

7.3 靶向SIRTs SIRT1 是目前最受關注的SIRTs，也是近年來藥物設計的新靶標。非黃酮類多酚化合物白藜蘆醇作為SIRT1 經典激活劑，對AKI 及DKD具有腎臟保護作用［89］。SRT1720 是一種比白藜蘆醇更有效的小分子SIRT1 激活劑，已被證實可改善順鉑誘導的AKI 及單側輸尿管梗阻引起的腎臟纖維化［90］，對DKD 也具有一定的腎臟保護作用［91］，其機制可能與調節細胞自噬有關，但仍需深入研究加以證實。

7.4 其它調節自噬的成分或藥物 TFEB 是調控自噬活性、維持細胞自噬溶酶體通路穩定的關鍵轉錄因子，因此也是調節自噬的理想靶點。目前發現許多中藥有效成分或提取物如姜黃素、木黃酮和海藻糖等具有激活TFEB 轉錄的作用。有報道姜黃素可通過抑制PI3K-AKT-mTOR 信號通路，激活TFEB 而增強自噬活性及溶酶體生物發生［92］，且不依賴于mTOR 的抑制活性。木黃酮可激活TFEB 轉錄，增加其表達量，并通過抑制mTOR 活性而促進TFEB 磷酸化入核，通過改善溶酶體功能而增強自噬［93］。海藻糖通過抑制AKT 而激活AMPK，促使TFEB 活化入核，發揮調節自噬的作用。目前，上述藥物通過調節自噬延緩腎臟疾病進展大多仍處于動物試驗階段，具有一定臨床開發的前景。此外，鋰和卡馬西平等可降低細胞內磷酸肌醇水平，而米諾地爾和Tat-beclin 1 肽類藥物可調節K+-ATP 通道開放［94］。它們已被證實在AKI、DKD、局灶性節段性腎小球硬化或多囊腎等動物模型中通過誘導腎臟固有細胞自噬而發揮腎臟保護作用［95］。

迄今為止，使用靶向細胞自噬研發的激動劑或抑制劑防治腎臟疾病仍然面臨挑戰，自噬在不同的腎臟疾病及不同的腎臟細胞類型，以及疾病進展不同階段可能發揮著不同的作用，其詳細調控機制和信號傳遞也有待進一步明確。目前自噬調節劑應用還缺乏臨床試驗證據，需要加快研究步伐。

專家推薦意見七：1. 靶向自噬通路有望成為腎臟疾病防治的新策略，建議進一步開展靶向mTOR、AMPK、SIRT 等信號通路的研究，探討其對各種腎臟疾病的作用與機制。2. 推薦采用小分子肽類化合物或中藥有效成分觀察它們對自噬、自噬-溶酶體通路關鍵轉錄因子的調節作用及對實驗性腎病的效果與機制。3. 建議在安全有效的前提下，逐步加強以自噬為靶點的腎臟病臨床防治研究。

8 結語

隨著對細胞自噬機制認識的不斷深入以及檢測手段的提升，細胞自噬在各種人類疾病中的作用越來越受重視，細胞自噬檢測極有可能成為疾病診斷新手段，而自噬調控極有可能成為疾病防治的新措施。當前，自噬在腎臟疾病中的研究雖然也取得了一定成績，但仍主要處于基礎探索階段，在腎臟疾病診治中的應用還有待于開發。為此，我們制定了細胞自噬在腎臟疾病研究的理論和實踐中國專家共識。希望本共識對有興趣從事自噬與腎臟病研究的醫務人員和科研人員在實際工作中有所幫助，并推動我國腎臟病領域自噬相關研究的發展，使自噬最終成為腎臟疾病診治新策略。

附錄

利益沖突：無。

專家組成員（按姓氏筆畫排序）：丁國華（武漢大學人民醫院），王偉銘（上海交通大學附屬瑞金醫院），王惠明（武漢大學人民醫院），劉友華（南方醫科大學南方醫院），劉華鋒（廣東醫科大學附屬醫院），孫世仁（空軍軍醫大學西京醫院），莊守綱（上海同濟大學附屬東方醫院），劉芳（四川大學華西醫院），孫林（中南大學湘雅二醫院），肖力（中南大學湘雅二醫院），陳旻（北京大學第一醫院），陳朝紅（南京總醫院），陸晨（新疆維吾爾自治區人民醫院），楊俊偉（南京醫科大學第二附屬醫院)，張愛華（南京醫科大學附屬兒童醫院），鄭豐（大連醫科大學附屬第二醫院），趙景宏（陸軍軍醫大學第二附屬醫院），曾科（南京大學生命科學學院），焦軍東（哈爾濱醫科大學附屬二院），譚小月（南開大學醫學院），戴春筍（南京醫科大學第二附屬醫院）

學術秘書：葉蓁楠（廣東醫科大學附屬醫院），周陽（南京醫科大學第二附屬醫院）