食管癌與微生態(tài)的相關(guān)研究進(jìn)展

呂文晶，左靜

1河北醫(yī)科大學(xué)研究生院，石家莊 050011

2河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，石家莊 050011

食管癌發(fā)病率居全球惡性腫瘤第七位，病死率居第六位。中國是食管癌高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率及病死率均居惡性腫瘤前列。食管癌的組織學(xué)類型主要包括食管腺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC），中國食管癌以ESCC 更常見，占比超過90%。食管癌的發(fā)病因素較多，吸煙、飲酒、飲食粗糙等對(duì)食管造成損傷的各類慢性刺激，環(huán)境因素，以及遺傳因素均是導(dǎo)致食管癌的可疑病因，但導(dǎo)致食管癌的關(guān)鍵因素仍不能明確。因?yàn)槿狈`敏度、特異度高的早期診斷指標(biāo)及方法，多數(shù)患者初次確診時(shí)就已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者的5 年生存率不足20%。因此，臨床需要不斷探索食管癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，以尋找新的食管癌診斷和治療方法。近年來，對(duì)微生物組的研究成為惡性腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，從口腔至肛門，超過100 萬億個(gè)細(xì)菌在人體內(nèi)棲息，并在人體器官中形成了特定菌群（微生物組）。一方面，這些微生物從局部維持穩(wěn)態(tài)到系統(tǒng)地調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、造血、炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)等方面均發(fā)揮著重要作用；另一方面，微生態(tài)失調(diào)可能導(dǎo)致組織損傷，從而促進(jìn)產(chǎn)生致癌代謝物的細(xì)菌過度增殖，并在各種疾病中發(fā)揮重要作用，包括炎性疾病和腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程。個(gè)體化的微生物群研究是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，是對(duì)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的補(bǔ)充和延伸。已有研究證實(shí)，腸道微生物組在生理狀況和疾病狀態(tài)中均發(fā)揮著重要作用，如肥胖、炎癥性腸病、糖尿病和高血壓等，但臨床對(duì)食管微生物的研究甚少。本文主要闡述食管癌在微生態(tài)領(lǐng)域取得的研究進(jìn)展，以進(jìn)一步了解食管癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為臨床制訂有效的診斷和治療方法提供新思路。

1 正常食管與微生態(tài)

對(duì)食管微生物群的第一次研究可以追溯至20世紀(jì)80 年代早期Gagliardi 等的研究，該研究是基于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，證實(shí)食管不是一個(gè)無菌的環(huán)境，食管不僅受鄰近器官（口腔及胃部）微生物的影響，也存在原籍定植菌，其中以草綠色鏈球菌最為常見。但多種細(xì)菌的生長較為緩慢，甚至無法培養(yǎng)，因此，簡(jiǎn)單的培養(yǎng)方法可能會(huì)忽略大量細(xì)菌，且與其他部位相比，食管取樣困難也限制了對(duì)食管微生物群的研究。16S 核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）基因測(cè)序的出現(xiàn)，為食管微生物群落的研究提供了根本性的突破，結(jié)果表明，食管內(nèi)含有多種微生物群。2004 年，Pei 等研究發(fā)現(xiàn)，食管微生物群主要由“六個(gè)門”構(gòu)成，即厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形桿菌門、梭桿菌門和TM7，與口腔微生物群相當(dāng)，但重要分類存在差異。鏈球菌屬在食管微生物群中占主導(dǎo)地位（占39%）。2004 年起，越來越多的研究開始探討食管微生物群，并提出了食管微生物群分類的概念。2009 年，Yang 等將食管微生物分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型微生物群主要類型為革蘭陽性菌（15%），厚壁菌門，主要為鏈球菌（相對(duì)豐度為79%），與正常食管密切相關(guān)；而Ⅱ型微生物群主要類型為革蘭陰性菌（53%），主要與食管異常有關(guān)。2016年Di Pilato等和2018年Deshpande等的研究也得出了相同的結(jié)論。由此可見，食管微生態(tài)改變可能與食管疾病相關(guān)，某些微生物的存在可能促進(jìn)食管疾病的發(fā)生發(fā)展。

2 食管腺癌與微生態(tài)

近年來，食管腺癌的發(fā)病率不斷上升，尤其是在西方國家。研究發(fā)現(xiàn)，食管腺癌的發(fā)病過程為：胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）—Barrett 食管—低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變—高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變—食管腺癌。短期反流被認(rèn)為是生理性的，但反流癥狀反復(fù)時(shí)，就會(huì)發(fā)生GERD，引起與炎癥（食管炎）相關(guān)的食管黏膜損害。Snider 等研究Barrett 食管向食管腺癌進(jìn)展過程中微生物結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Barrett 食管和健康對(duì)照組間微生物多樣性無明顯差異，而食管腺癌患者的微生物多樣性有所下降。總體來講，在門水平上，與健康或低級(jí)別病變患者相比，高度不典型增生或食管腺癌的變形桿菌門豐度較高，厚壁菌門豐度降低。在屬水平上，高度不典型增生或食管腺癌的總腸桿菌和艾克曼菌的豐度增加，而韋榮球菌的豐度降低。Yang 等的研究顯示，食管炎或Barrett 食管患者中，微生物多樣性會(huì)發(fā)生變化，鏈球菌的種類會(huì)減少，革蘭陰性厭氧菌占比會(huì)增大，如韋榮球菌屬、普氏菌屬、梭桿菌屬、奈瑟菌屬。Liu等的研究顯示，與健康對(duì)照組相比，GERD 相關(guān)性食管炎和Barrett 食管中的食管微生物群富集了普氏菌屬和梭桿菌屬。這種從革蘭陽性需氧微生物群至革蘭陰性厭氧微生物群的轉(zhuǎn)變可能受到微環(huán)境變化的影響，并與異常的疾病狀態(tài)有關(guān)。Ⅱ型微生物群可能通過以下三種不同的機(jī)制影響食管正常的生理功能：①革蘭陰性菌中存在的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可 激 活Toll 樣 受 體（Toll-like receptor，TLR），并促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-8 的分泌，這是正常食管向Barrett 食管轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。在Barrett食管和Barrett 食管相關(guān)的食管腺癌患者中，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通過Barrett 食管的致癌作用進(jìn)行表達(dá)，且NF-κB 在食管腺癌中的表達(dá)與新輔助化療和放療間存在相關(guān)性。總體來講，在GERD 和Barrett 食管中，微生物群的變化（即革蘭陰性菌增多）可能通過誘發(fā)慢性炎癥觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致食管腺癌。②革蘭陰性菌可以激活誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase one，NOS1），其激活降低了食管下括約肌的蠕動(dòng)頻率，長期會(huì)增加食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。③革蘭陰性菌也可以將食物中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽又可以在賁門和遠(yuǎn)端食管的酸性環(huán)境中轉(zhuǎn)化為致癌的N-亞硝基化合物。Lopetuso 等探討從Barrett 食管進(jìn)展至食管腺癌的連續(xù)光譜中，食管微生物群的潛在特征及其預(yù)測(cè)的功能特征，為Barrett食管提出了新思路，不僅可以作為食管腺癌的組織學(xué)前體，也可以作為食管腺癌最接近的微生物前體。這需要更大樣本量的后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)，但為食管腺癌的診斷和治療提供了新思路，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

Blackett 等研究發(fā)現(xiàn)，某些彎曲桿菌（主要為簡(jiǎn)明彎曲桿菌）在Ⅱ型微生物群中持續(xù)性富集，也被認(rèn)為與疾病進(jìn)展為食管腺癌有關(guān)，可能因?yàn)閺澢鷹U菌可通過上調(diào)食管中IL-18 的表達(dá)促進(jìn)干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）誘導(dǎo)因子的表達(dá)來介導(dǎo)食管腺癌的發(fā)生發(fā)展。Kaakoush 等的研究指出，簡(jiǎn)明彎曲桿菌是微生態(tài)改變引起食管腺癌發(fā)生的使動(dòng)因素，這為其他菌群在腫瘤微環(huán)境中競(jìng)爭(zhēng)為優(yōu)勢(shì)菌群并參與疾病進(jìn)展提供了有利條件。Gall等研究發(fā)現(xiàn)，鏈球菌與普氏桿菌的比例與Barrett 食管和食管腺癌的一些重要危險(xiǎn)因素（如腰臀比、裂孔疝長度）間存在關(guān)聯(lián)，并鼓勵(lì)開展進(jìn)一步研究以調(diào)查這一發(fā)現(xiàn)的臨床意義。

3 ESCC 與微生態(tài)

與食管腺癌相比，ESCC 中微生物組的特征不明顯。Shao 等的研究發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤組織相比，ESCC 組織含有更多的梭桿菌（3.2%

vs

1.3%）和更少的鏈球菌（12.0%

vs

30.2%），梭桿菌屬的豐度與食管癌分期呈正相關(guān)。已有研究顯示，上消化道中較低的微生物豐度與食管鱗狀發(fā)育不良（ESCC 的前體病變）密切相關(guān)。

肖晗等將細(xì)菌與食管鱗癌細(xì)胞Eca109 等共同培養(yǎng)，并檢測(cè)其炎性因子水平，證實(shí)具核梭桿菌通過IL-6 對(duì)ESCC 細(xì)胞株具有促增殖作用；Transwell 等證實(shí)了具核梭桿菌通過CC 趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）7/CCL21 通路、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2/MMP9通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。Gao 等研究了特定細(xì)菌在ESCC 發(fā)病機(jī)制中的可能作用，該研究著重探討了ESCC 與牙齦卟啉單胞菌（一種被認(rèn)為與口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生有關(guān)的口腔致病菌）間的可能關(guān)系，結(jié)果顯示，牙齦卟啉單胞菌可以選擇性地感染ESCC 患者的腫瘤組織和癌旁組織，但不能感染正常食管黏膜。牙齦卟啉單胞菌的促癌機(jī)制：牙齦卟啉單胞菌可產(chǎn)生牙齦蛋白酶和MMP，降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，破壞免疫球蛋白和補(bǔ)體系統(tǒng)（C3、C5），進(jìn)而通過影響前列腺素E2 途徑和Notch 途徑，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞及腫瘤新生血管生成，進(jìn)而分化、進(jìn)展為ESCC。此外，牙齦卟啉單胞菌的存在與ESCC 的嚴(yán)重程度（即分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM 分期）和預(yù)后不良（即ESCC 患者的生存率）呈正相關(guān)，因此，有學(xué)者提出，牙齦卟啉單胞菌可以作為ESCC的生物標(biāo)志物。以微生物作為食管癌的生物標(biāo)志物為切入點(diǎn)，有利于食管癌的早期篩查，期待基于微生物的潛在的分子靶點(diǎn)的研究。

4 食管微生態(tài)的影響因素

研究顯示，抑酸藥如質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitor，PPI）對(duì)胃腸道微生物有重要意義，且PPI 治療前后食管微生物群發(fā)生了明顯變化，服用PPI 的患者總體上革蘭陽性菌增多，革蘭陰性菌減少。但PPI 介導(dǎo)上消化道微生物群變化及其二者之間是否存在特定關(guān)系、是否參與食管癌的發(fā)生、是否為PPI 自身的致癌作用仍然未知，尚需進(jìn)一步研究加以確認(rèn)。但Tasnim 等的研究顯示，PPI 可能不會(huì)引起食管遠(yuǎn)端微生物菌群的明顯變化，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行更大樣本的研究，以確定PPI 與食管微生物菌群的關(guān)系。

抗生素的使用可促進(jìn)食管下段疾病的發(fā)生，這可能與抗生素會(huì)根除幽門螺桿菌有關(guān)。幽門螺桿菌在胃微生物群中占主導(dǎo)地位并可明顯增加胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但與食管腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。研究顯示，在觀察到食管腺癌發(fā)病率升高之前，幽門螺桿菌感染率在20 世紀(jì)中葉開始下降。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，幽門螺桿菌感染率下降及隨后食管腺癌發(fā)病率上升間存在的時(shí)間關(guān)系，表明胃腸道微生物菌群可能在Barrett 食管和食管腺癌的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵的致病作用。日本學(xué)者Abe等研究證實(shí)，胃潰瘍的患者采用抗生素清除幽門螺桿菌后出現(xiàn)了食管下端的惡性腺瘤。Tian 等的研究結(jié)果表明，使用抗生素根除幽門螺桿菌感染會(huì)影響下段正常的食管微生物菌群。幽門螺桿菌感染降低與食管腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加的機(jī)制為：抗生素根治幽門螺桿菌后，各種炎性因子如IL-8、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）減少，進(jìn)而減少胃黏膜損傷，升高胃酸水平，增加胃酸相關(guān)性食管損傷風(fēng)險(xiǎn)。微生物菌群作為食管微環(huán)境的重要組成部分，可通過多種調(diào)控系統(tǒng)和途徑維持食管微環(huán)境的穩(wěn)定和平衡；在解剖結(jié)構(gòu)上，食管下端與胃緊密相連，幽門螺桿菌定植于胃內(nèi)，可能會(huì)引起食管下段菌群結(jié)構(gòu)的改變，采用抗生素清除幽門螺桿菌感染也可能引起食管內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的改變。英國的一項(xiàng)基于人群的隊(duì)列研究結(jié)果表明，青霉素暴露與各種惡性腫瘤（包括食管癌）的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加存在劑量依賴性關(guān)系，但未明確指出食管癌的類型（食管腺癌或ESCC）。由于青霉素沒有直接的致癌作用，這種增加的腫瘤風(fēng)險(xiǎn)可能是因?yàn)榭股厥褂煤笫彻鼙Ｗo(hù)性細(xì)菌（如鏈球菌）減少。

5 基于微生態(tài)的食管癌影響因素

Nobel 等納入47 例食管癌患者，進(jìn)行為期4周的膳食回憶食物頻率調(diào)查問卷，該問卷確認(rèn)了脂肪和纖維的攝入量；隨后對(duì)這些患者進(jìn)行了食管內(nèi)窺鏡檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增加纖維攝入量與厚壁菌門的相對(duì)豐度增加呈正相關(guān)，且可整體上降低變形菌和革蘭陰性菌的相對(duì)豐度。此外，基于脂肪攝入膳食的微生物菌群改變相對(duì)較少。

煙草是ESCC 主要危險(xiǎn)因素之一。Vogtmann等研究發(fā)現(xiàn)，未戒煙者食管內(nèi)菌群的α 多樣性高于不曾吸煙者和已戒煙者，β 多樣性低于不曾吸煙者和已戒煙者，而不曾吸煙者和已戒煙者α 多樣性和β 多樣性無明顯差異。煙草致癌的可能機(jī)制為：低濃度香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）通過抑制miRNA-101-3p 的表達(dá)，阻斷對(duì)環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase 2，COX2）mRNA 表達(dá)通路的抑制，從而上調(diào)COX2 的表達(dá)，促使依賴COX2活性的CSE 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)ESCC 的發(fā)生。Gong 等進(jìn)一步指出，miRNA-101-3p 可能是與吸煙相關(guān)ESCC 的潛在標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

此外，胃微生物菌群的改變也與食管發(fā)育不良和ESCC 有關(guān)。伊朗進(jìn)行的一項(xiàng)病例對(duì)照研究顯示，胃底某些微生物，如梭菌門的梭狀芽孢桿菌的豐度增加，與食管鱗狀異型增生和ESCC 有關(guān)。口腔微生物菌群的改變也可能與食管癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，Chen 等的研究顯示，唾液中細(xì)菌菌群的改變與ESCC 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)。Peters 等的研究證實(shí)，牙周病也增加了ESCC 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。Poyrazoglu 等研究發(fā)現(xiàn)，與健康者相比，ESCC 患者的幽門螺桿菌感染率明顯降低（

P

﹤0.01）。ESCC患者在白細(xì)胞增多癥和血紅蛋白不足與幽門螺桿菌感染呈正相關(guān)（

P

﹤0.05）。Doorakkers 等的研究發(fā)現(xiàn)，Barrett 食管的總發(fā)病率升高，但根除幽門螺桿菌后，發(fā)病率隨時(shí)間推移略有下降，根除幽門螺桿菌不影響ESCC 的發(fā)病率。Deshpande 等的研究發(fā)現(xiàn)，食管菌群的特征與基因、年齡和疾病相關(guān)。鏈球菌和普雷沃菌與ESCC 患者的預(yù)后相關(guān)。Poore 等與跨學(xué)科團(tuán)隊(duì)共同開發(fā)了一種惡性腫瘤檢測(cè)的新方法，即通過分析血液中存在的微生物（細(xì)菌和病毒）的DNA 模式來明確受試者是否診斷為惡性腫瘤，且能進(jìn)一步明確惡性腫瘤的類型。期待這種惡性腫瘤診斷方法能開啟與腫瘤相關(guān)的血液微生物組學(xué)研究，填補(bǔ)食管癌血液微生態(tài)研究領(lǐng)域的空白，為食管癌的早診斷、早治療帶來新希望。

6 基于微生態(tài)食管癌治療的新進(jìn)展

近二十年來，隨著腫瘤免疫學(xué)的深入研究，腫瘤免疫治療已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。研究表明，機(jī)體的微生物群也會(huì)影響機(jī)體對(duì)抗腫瘤治療的反應(yīng)及對(duì)藥物不良反應(yīng)的敏感性。在基于程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）/程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）抗體的免疫治療領(lǐng)域，食管癌患者體內(nèi)的不同的微生物群結(jié)構(gòu)可能影響機(jī)體對(duì)免疫治療的響應(yīng)程度。基于此，Yuan 等以腫瘤免疫微環(huán)境為切入點(diǎn)，從基因測(cè)序結(jié)果出發(fā)，發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌定植于食管癌細(xì)胞，是近年來食管癌病因研究領(lǐng)域的重大突破，對(duì)食管癌的高危人群進(jìn)行預(yù)警篩查和個(gè)體化預(yù)防具有重要意義。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌定植于食管癌細(xì)胞后可誘導(dǎo)免疫檢查點(diǎn)分子B7-H4 及組蛋白去甲基化酶5B（lysine demethylation 5B，KDM5B）高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃避或破壞宿主免疫應(yīng)答，進(jìn)而持久定植。感染和腫瘤的雙重因素，加重了宿主免疫的抑制及免疫原性的削弱。該研究進(jìn)一步探討了牙齦卟啉單胞菌促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的新機(jī)制，為免疫檢查點(diǎn)抑制劑進(jìn)行抗食管癌治療提供了新靶標(biāo)，為基于微生態(tài)的食管癌的免疫治療提供了新策略。

7 小結(jié)與展望

現(xiàn)有的研究已基本確定了正常食管微生態(tài)的細(xì)菌組成情況，食管微生態(tài)菌群的改變和各種微生物的感染在食管癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，但食管微生態(tài)成分的改變與食管病變或癌變的因果關(guān)系及具體機(jī)制尚不能完全明確，也未能找到特定引起食管癌癌變的菌種。進(jìn)一步了解食管微生物群在疾病發(fā)病機(jī)制中的作用，以及微生物群改變的方法，可能為食管癌的治療提供了新的靶點(diǎn)或信號(hào)通路，或成為各種食管疾病高危患者的篩查工具。未來的研究或可進(jìn)一步采用宏基因組學(xué)方法、擴(kuò)大樣本數(shù)量、繪制同一批患者食管多位點(diǎn)微生物圖譜，研究微生物在食管癌中的作用機(jī)制及關(guān)鍵通路的改變，旨在為食管癌的早期防治提供新的方向和思路。