精索靜脈曲張患者手術前后MT-COI和MT-COII基因表達的水平變化及對精子的影響分析

梁高照，王茜茜，汪 清

（1深圳市寶安人民醫院（集團）泌尿疾病中心 廣東 深圳 518000）

（2深圳市寶安人民醫院（集團）風濕免疫科 廣東 深圳 518000）

精索靜脈曲張（VC）是指男性精索中的蔓狀靜脈叢發生異常擴張、迂曲和延伸，是影響男性生育的主要因素之一。有資料表明[1]，有將近30%的不育癥男性患者同時患有VC。VC出現與吸煙、平時生活習慣密切相關，同時過于勞累、長時間進行劇烈運動也可促使疾病發生。由于日常生活中，男性經常處于過度勞累狀態，導致其自身植物神經紊亂，精索靜脈發生病變，從而出現VC。當前，臨床在VC治療時多采取手術，據有關研究顯示[2]，經手術能提升VC患者的精子DNA質量。線粒體DNA氧化受損和多類疾病出現相關，當前有關手術對VC患者基于部分線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ、Ⅱ（MT-COI、MTCOII）基因表達水平的影響較少。為此，本文就VC患者術前術后的MT-COI、MT-COII基因表達水平改變和對精子的影響開展分析，現報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020年1月—2021年4月本院本院收治VC患者共64例，年齡25～68歲，平均年齡（56.25±5.30）歲。納入標準：①患者平靜時呼吸其精索靜脈最大內徑（DR）≥1.8 mm，行Valsalva實驗時，其精索靜脈最大內徑（DV）≥2.0 mm；Valsalva實驗結果顯示為陽性，實驗時頻譜和彩色多普勒測及反流信號，且TR≥1 s，需滿足以上所有標準才能被確診為VC；②符合手術指征，均于本院開展手術治療；③均取得患者知情同意。排除標準：①肝腎心等重要臟器存在嚴重疾病者；②免疫、血液系統存在疾病者；③存在認知障礙或者精神疾病者；④生殖系統存在其他疾病者；⑤近期接觸過毒物、射線或者高溫者；⑥中途退出或者拒絕參與研究者。

1.2 方法及觀察指標

所有患者均由相同一組醫師開展手術操作，同時術前術后對MT-COI、MT-COII基因表達水平、精子計數、精子活力、精液體積以及精子DNA片段化指數（DFI）開展檢測，方法如下：（1）MT-COI、MT-COII基因檢測：通過RNeasy Mini Kit按照試劑盒中說明書開展操作提取總DNA，后采取DNase 1 Digesting Set將總DNA內痕量DNA去除，選擇1 μg的RNA樣品作為模板，經PCR法對MT-COI、MT-COII基因全片段（901bp）開展擴增處理，擴增引物是MT-COI（+）、MT-COII（+）（5’-CAAGCCAACCCC-ATGGCCTCC-3’）與MT-COI（-）、MT-COII（-）（5’-AGTATTTAGTT-GGGGCATTTCAC-3’），同時PCR的擴增條件是：95°C環境下變性4 min，后依據95°C環境下變性1 min、50°C環境下退火1 min以及72°C環境下延伸2 min反應條件進行30次循環，于72°C環境下進行10 min延伸，結束首次PCR反應。選擇1 μg首次PCR擴增引物當作模板用于第2次PCR擴增。擴增引物是MT-COI（+）、MT-COII（+）（5’-CAAGCCAACCCC-ATGGCCTCC-3’）與 qhR（5’-TCCTGAGCGTCTGAGATG-3’），同時 PCR 的擴增條件是：95°C環境下變性4 min，后依據95°C環境下變性30 s、50°C環境下退火45 s、72°C環境下延伸1 min反應條件進行30次循環，于72°C環境下延伸10 min后結束第2次的PCR反應，且擴增產物于1.3%瓊脂糖內的電泳條件是5 volt/cm。對瓊脂糖電泳的凝膠內多態性擴增片段開展切取，經割膠純化有關試劑盒開展純化，經T4 DNA連接酶對pUC-T載體與巢式PCR純化引物開展連接反應，經Cacl2轉化方法轉進重組質粒到TG1大腸桿菌的感受態細胞內，提取及純化質粒DNA均依據傳統方式開展。經M13通用引物開展2次序列測定，具體測序反應為上海聯合基因公司進行。（2）精子及精液檢測：收集患者禁欲72 h的精液樣本，后于1 h內開展檢測，常規精液參數采取人工分析方法，分別由3名專業操作人員獨立分析，后取三者平均數值；經美國貝克曼Navios流式細胞儀對精子計數及活力進行檢測；經末端轉移酶引導dUTP末端標記方法對精子DFI開展檢測，試劑盒為Roche公司提供，嚴格依據說明書執行各項操作。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0統計軟件進行數據處理。正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料用頻數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 術前術后MT-COI、MT-COII基因表達比較

術后，VC患者的MT-COI、MT-COII基因表達比術前有降低（P＜0.05），見表1。

表1 術前術后MT-COI、MT-COII基因表達比較（±s, μmol/mg·pro）

表1 術前術后MT-COI、MT-COII基因表達比較（±s, μmol/mg·pro）

組別 例數 MT-COI MT-COII術前 64 0.32±0.05 0.40±0.06術后 64 0.18±0.04 0.21±0.05 t 17.491 19.462 P 0.001 0.001

2.2 術前術后精子及精液參數比較

術后，VC患者的精子活力及計數比術前有升高，精子DFI比術前有降低，差異有統計學意義（P＜0.05），精液體積和術前相比，差異無統計學意義（P＞0.05），精子DFI降低（P＜0.05）。見表2。

表2 VC患者術前術后精子及精液參數對比（±s）

表2 VC患者術前術后精子及精液參數對比（±s）

組別 例數 精子活力（a=b）/%精子計數/（miL?mL-1） 精液體積/mL 精子DFI術前 64 18.85±3.62 34.52±10.20 2.75±0.56 42.65±6.10術后 64 38.75±6.40 42.86±11.38 2.84±0.52 20.42±3.46 t 21.651 4.366 0.942 25.359 P 0.001 0.001 0.348 0.001

3.討論

VC屬于引發男性不育的一類主要疾病，會給男性的生育能力帶來嚴重影響。但當前有關VC導致生殖細胞出現功能障礙的具體機制仍未完全明確，現代醫學多認為和氧化應激相關，此外，還可能和激素水平變化、睪丸組織的病理生理變化等相關，但討論較多的為睪丸生殖細胞氧化應激學說[3]。

目前，手術屬于VC患者一類主要療法。MT-COI、MT-COII可調節線粒體的氧化呼吸產能，于中樞神經系統有關能量代謝、功能發揮中起著關鍵性作用，兩類基因表達水平越高，代表氧化應激損傷越為嚴重[4]。本次研究發現，術后，VC患者的MT-COI、MT-COII基因表達比術前顯著下降，說明經手術治療能下調患者MT-COI、MT-COII基因的表達水平。據有關研究表明[5]，于VC患者精液內伴隨活性氧，活性氧生成過多以及抗氧化作用下降能引發氧化應激，ROS過度可將精子細胞膜脂質過氧化啟動，產生較多脂質過氧化物，使得MT-COI、MTCOII水平上升，對精子的細胞膜產生損傷，引發精子功能及形態變化，并能對精子核酸及蛋白質功能產生影響，最終引發精子DNA受損。雖常規精液參數能提供出一定價值信息，但也有一定局限性，精子質量多需結合活動度以及形態等評定[6]。有學者認為[7]，男性不育患者的正常形態精子也有高DNA斷裂存在，由此可見，和常規精液參數開展比較，檢測DFI有著不可取代的價值。本次研究發現，術后VC患者的精子活力及計數比術前升高，且精子DFI比術前降低，這和鄧浩等[8]研究中的結果有著良好一致性，說明經手術能改善VC患者的精子參數，減輕精子DNA受損，該結果一定程度上證實了VC手術能對男性不育開展治療的學說。

綜上所述，VC患者經手術治療能降低其MT-COI、MT-COII基因表達水平，提升其精子活力和計數，減輕其精子DNA損傷。但研究中依舊有一定不足，例如樣本總量較少，未對后期懷孕率等開展隨訪，這些還需在日后研究中進一步完善。