血管緊張素II通過PI3K/Akt/FOXO1信號通路誘導骨骼肌細胞萎縮

李文雄 丁凡 付勇芳 施杞,3 張巖,3*

1. 上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032 2. 陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712000 3. 教育部筋骨理論與治法重點實驗室，上海 200032

肌肉是一種可塑性組織，能根據內外刺激而不斷調整自身的形態、大小以及功能。局部肌肉萎縮常發生在制動或是神經缺失的肌肉中，如骨折后石膏固定的肢體、脊髓損傷后失去神經支配的肌肉等。老年、禁食或是營養不良的人群常會出現全身性的肌肉萎縮，這是機體的一種生理應答；同時，全身性肌肉萎縮還是對多種疾病的病理性應答，包括敗血癥[1]、艾滋病、腎功能衰竭[2]、心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病[3]、糖皮質激素過多[4-5]和腫瘤惡病質[6-7]等。但目前對于肌肉萎縮的致病機制還不甚清晰，肌肉萎縮的治療多局限于物理康復訓練和少部分激素類藥物的治療。因此，深入探究肌肉萎縮的致病機制，對于采取有針對性的干預措施，研發抗骨骼肌萎縮藥物，提高生活質量至關重要[8]。

血管緊張素II(angiotensin II, Ang II)是腎素-血管緊張素系統(renin angiotensin system, RAS)中的主要活性肽，通過與靶器官細胞膜上的特異性受體結合而發揮生理和病理效應。除了傳統循環中的RAS以外，在骨骼肌中檢測到血管緊張素轉換酶活性和Ang II 1型受體(AT1R)的表達[9-10]，提示Ang II在骨骼肌中也發揮著一定的調控作用。PI3K/Akt信號通路是調控肌肉生長活動的重要信號通路[11-12]。在大多數細胞中，該途徑控制著細胞分裂，但在不分裂的肌肉細胞中，它會刺激機體蛋白質合成并抑制蛋白質降解[13]。在肌肉中，PI3K/Akt信號的磷酸化能夠通過促進FOXO的磷酸化[14]來促進凈蛋白積累，非磷酸化的FOXO位于細胞核中，通過促進肌萎縮基因(MURF1和MAFbx等)的表達，加劇肌萎縮；當FOXO被Akt磷酸化后，會向細胞質中轉位，失去對肌萎縮基因的調控作用[15]。

因此，本文擬使用Ang II及其AT1R拮抗劑(AT1R blocker, ARB)奧美沙坦干預骨骼肌細胞，以探究Ang II是否在骨骼肌萎縮中發揮著一定的調控作用及其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 試劑

血管緊張素II(Ang II)(日本PEPTIDE Institute公司，4001-V)；奧美沙坦(美國Sigma公司，SML-1394)；細胞用血清(上海博升生物，019BS0623)；胰酶(0.25 %-EDTA，法國Biosera公司，11566)；雙抗(penicillin-streptomycin solution)(法國Biosera公司100X，12189)；RIPA裂解液(強)(碧云天生物，P0013B)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物，P0012 S)；MHC一抗(ab91506和ab51263)、MAFbx一抗(ab168372)和GAPDH一抗(ab181602)均購自英國Abcam公司；MyoD一抗(sc-37460)、MURF1一抗(sc-398608)均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；山羊抗兔IgG(H+L)(A0208)、山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)均購自碧云天生物；抗兔的熒光二抗IgG (H+L)(美國，Cell Signaling Technology，4412)。

1.2 儀器

純水儀(德國Think-Lab，W3T262974)；高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific，75002445)；酶標儀(美國Bio Tek，Cytation3)；蛋白印跡電泳系統(美國Bio-Rad，731BR01657)；凝膠成像系統(美國Bio-Rad，ChemicDoc)；全片掃描儀(日本Olympus，VS120-SL)；細胞培養箱(德國Think-Lab，W3T262974)。

1.3 細胞

小鼠骨骼肌來源的C2C12成肌細胞，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.4 方法

1.4.1C2C12細胞的培養、分化和分組：購買的C2C12成肌細胞使用生長培養基(DMEM培養基+10 %胎牛血清+1 %雙抗)培養，隔天換液1次，觀察細胞生長狀態，待細胞生長至70 %～80%融合時，按1∶3傳代。待細胞生長穩定后，使用2 %的馬血清誘導分化為肌管細胞。

C2C12細胞生長穩定后，待細把生長至80 %左右融合后，更換生長培養基為分化培養基(DMEM培養基+2 %馬血清+1 %雙抗)，誘導細胞分化，隔天換液，5 d后可見成肌細胞融合分化為肌管細胞。

細胞分組：3組。對照組(Control)：溶劑干預；模型組(Ang II)：Ang II(10-7mol/L)干預48 h；奧美沙坦組(Ang II +ARB)：先用奧美沙坦(10-6mol/L)干預30 min后，使用Ang II(10-7mol/L)干預48 h。

1.4.2免疫熒光染色：細胞鋪板于12孔板細胞爬片上，分化5 d后形成肌管細胞，4 %多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗；0.2 % Triton X-100室溫通透20 min，PBS浸洗，吸水紙吸干，滴加5 % BSA，室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，滴加足量的1 % BSA稀釋好的一抗(MHC 1∶200)，濕盒中4 ℃孵育過夜。第二天回收一抗，PBS浸洗爬片，吸水紙吸干爬片上多余的液體，滴加1 % BSA稀釋好的熒光二抗(山羊抗小鼠 1∶200)，室溫濕盒中孵育1 h，PBS浸洗后，用含DAPI封片液封片，VS120全片掃描儀下觀察采集圖像。

1.4.3Western blot實驗：藥物干預48 h后的細胞倒掉培養液，從待測樣本中提取細胞，BCA法檢測蛋白濃度，煮沸變性，-20 ℃冰箱保存。用SDS-PAGE凝膠電泳分離等量的蛋白樣品，然后將蛋白轉移到PVDF膜上，用5 %的BSA于室溫中封閉1 h后，使用不同的一抗(包括：MHC、MyoD、MURF1和MAFbx)于4 ℃搖床上孵育過夜。第二天使用山羊抗兔或小鼠 IgG-辣根過氧化物酶的二抗孵育1 h后，于凝膠成像系統檢測目的蛋白含量的變化。采用Image J圖像分析軟件進行灰度值分析，目的蛋白的表達水平與GADPH灰度值比較得出。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 Ang II干預能夠使肌管細胞面積減小

如圖1所示，肌管細胞免疫熒光染色顯示，與Control組對比，Ang II干預后，肌管細胞的平均直徑和面積減小(P<0.001)；與Ang II組相比，使用奧美沙坦干預后，肌管細胞平均直徑和面積明顯增大(P<0.01)。

2.2 Ang II能夠促進肌管細胞泛素連接酶蛋白的表達

如圖2所示，肌管細胞蛋白Western blot結果顯示，與Control組對比，Ang II干預后，肌管細胞MURF1(P<0.05)和MAFbx(P<0.001)蛋白表達明顯升高；使用奧美沙坦干預后，MURF1(P<0.01)和MAFbx(P<0.01)蛋白表達降低。

注：A 為肌管細胞泛素連接酶蛋白MAFbx和MURF1的WB條帶圖；B為A中蛋白的定量結果。與 Control組相比，*P<0.05，*** P<0.001；與Ang II組相比，## P<0.01。圖2 WB 檢測肌管細胞泛素連接酶蛋白的表達Fig.2 The expression of myotubule ubiquitin ligase was detected by WB

2.3 Ang II能夠抑制肌管細胞生肌調節因子(MRFs)蛋白的表達

如圖3所示，肌管細胞蛋白Western blot結果顯示，與Control組對比，Ang II干預后，肌管細胞MHC(P<0.01)和MyoD(P<0.05)蛋白表達明顯降低；使用奧美沙坦干預后，MHC(P<0.001)和MyoD(P<0.001)蛋白表達升高。

注：A 為肌管細胞MRFs蛋白MHC和MyoD的WB條帶圖；B 為A中蛋白的定量結果。與 Control組相比，*P<0.05，**P<0.01；與Ang II組相比，###P<0.001。圖3 WB 檢測肌管細胞MRFs蛋白的表達Fig.3 The expression of MRFs was detected by WB

2.4 Ang II能夠抑制PI3K/Akt信號通路的磷酸化

如圖4所示，肌管細胞蛋白Western blot結果顯示，與Control組對比，Ang II干預后，肌管細胞PI3K(P<0.01)、Akt(P<0.001)和FOXO1(P<0.01)蛋白磷酸化降低；使用奧美沙坦干預后，PI3K(P<0.01)、Akt(P<0.001)和FOXO1(P<0.01)蛋白磷酸化較Ang II組升高。

注：A 為肌管細胞蛋白p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-FOXO1和FOXO1的WB條帶圖；B 為A中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-FOXO1/FOXO1的定量結果。與 Control組相比，**P<0.01，***P<0.001；與Ang II組相比，##P<0.01，###P<0.001。圖4 WB 檢測肌管細胞PI3K/Akt/ FOXO1信號通路蛋白的表達Fig.4 WB detected the expression of PI3K/Akt/ FOXO1 signaling pathway in myotube

3 討論

肌肉萎縮是一個受到嚴格程序控制的過程，涉及許多信號通路和效應蛋白，最終引起機體的合成和分解代謝平衡失衡，蛋白質降解大于蛋白質的合成，引起肌肉質量的降低。MURF1和MAFbx是兩種肌肉特異性E3泛素連接酶，能夠誘導蛋白的泛素化，以靶向26 S蛋白酶體進行蛋白水解，在多種肌萎縮誘導條件下均可見到這兩種蛋白表達增加[16-17]；更重要的是，抑制或是敲除這兩種蛋白，能夠改善，甚至是逆轉多種肌萎縮模型條件下的肌肉損失；在固定或去神經支配后，MAFbx缺失的小鼠對去神經支配誘導的骨骼肌萎縮有抗性[18]，MURF1基因的敲除能拮抗地塞米松誘導的骨骼肌和骨骼肌細胞萎縮[19-20]。因此，MURF1和MAFbx被廣泛的應用為肌肉萎縮的標記蛋白。本文實驗結果證實，Ang II干預后，C2C12細胞MURF1和MAFbx蛋白表達升高，而使用ARB干預后，MURF1和MAFbx蛋白表達明顯降低，說明Ang II能夠結合AT1R促進骨骼肌細胞蛋白的降解。

MyoD基因是生肌調節因子(myogenic regulatory factors, MRFs)[21]家族中調節成肌細胞分化方向的關鍵轉錄因子，是脊椎動物胚胎期肌肉發育的主導調控基因之一，對骨骼肌的形成和分化起主要作用，其缺失可導致成肌細胞的增殖和分化無法進行[18,22]。Tintignac等[23]研究發現，在C2C12成肌細胞中，MAFbx能與MyoD結合；過表達MAFbx，能夠介導MyoD的蛋白水解，并且抑制成肌細胞的分化以及肌管細胞的形成；相反，使用shRNA沉默肌管細胞的MAFbx基因后，能夠抑制的MyoD蛋白水解。同時，過表達MyoD突變基因，使MyoD不能與MAFbx結合，明顯改善了饑餓誘導的小鼠肌肉萎縮[18]，證實MyoD是MAFbx的泛素化底物之一。肌球蛋白廣泛存在于肌細胞中并作為一種細胞骨架組成成分存在于非肌細胞中，是肌肉中重要的結構和功能型蛋白，主要功能是為肌肉的收縮提供動力。肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC)是肌球蛋白的分子主干。研究發現，MURF1能夠泛素化結合MHC等多種蛋白，在地塞米松誘導的骨骼肌萎縮模型中，MURF1基因的敲除，能夠減少MHC蛋白的降解，改善骨骼肌萎縮；在體外C2C12細胞中，沉默MURF1基因能夠減輕地塞米松誘導的骨骼肌細胞的萎縮[19]。Bowen等[20]篩選出抑制MURF1基因的小分子化合物干預野百合堿誘導的肌萎縮模型，發現小分子化合物能夠改善肌肉萎縮和肌肉收縮功能障礙，提示MHC是MURF1的泛素化底物之一。文中研究結果證實，在Ang II干預后，肌管細胞平均直徑和面積明顯減小，隨著MURF1和MAFbx蛋白表達升高，MHC和MyoD蛋白表達降低，而是用ARB干預后，肌管細胞平均直徑和面積較Ang II增大，隨著MURF1和MAFbx蛋白表達的降低，MHC和MyoD蛋白表達升高，說明Ang II能夠抑制骨骼肌細胞蛋白的合成。

PI3K/Akt信號通路主要參與細胞增殖、分化等多種細胞功能的調節，研究發現，PI3K/Akt信號通路活性降低可導致肌肉萎縮[24-25]，抑制PI3K和Akt的表達可降低肌管大小[26]，缺乏Akt1和Akt2基因的的小鼠肌肉明顯減小[27]。相反，在大鼠肌肉中激活Akt基因可以防止因去神經支配而誘導的肌萎縮[28]。PI3K抑制劑能夠抑制地塞米松誘導的肌管細胞肌萎縮基因的表達和蛋白的降解[29-30]。提示激活PI3K/Akt信號通路能夠抑制肌原纖維蛋白的降解和肌萎縮基因的表達。FOXO轉錄因子是PI3K/Akt信號通路的一個下游靶點，在肌肉中具有三種亞型，FOXO1、FOXO3和FOXO4；當磷酸化時，這三種亞型都駐留在細胞質中，需要去磷酸化后才能進入細胞核中發揮轉錄作用[15,31]。Akt已經被證明可以磷酸化FOXO家族成員，從而阻止FOXO蛋白轉運到細胞核[24,32]。研究發現，FOXO家族轉錄因子也是MAFbx和MURF1基因表達的重要調控因子，多種肌萎縮模型都能促進FOXO轉錄因子的去磷酸化，促進肌萎縮基因MAFbx或MURF1等表達[24,33-34]。而當FOXO信號通路的缺失時，則抑制肌纖維表達MAFbx或MURF1的能力，改善肌萎縮[35]。實驗結果證實，Ang II干預后，能夠抑制PI3K、Akt和FOXO1的磷酸化，促使FOXO1從胞質轉位入核，促進肌萎縮基因MAFbx或MURF1蛋白的表達，而使用ARB預處理后，能夠拮抗Ang II對肌細胞的作用。

綜上可知，Ang II能夠通過結合AT1R抑制骨骼肌細胞PI3K/Akt/FOXO1信號通路的磷酸化，促進骨骼肌細胞蛋白的降解，抑制蛋白的合成。本文通過探究Ang II在骨骼肌萎縮中的作用機制，加深了人們對骨骼肌萎縮機制的認識，有助于研發干預、甚至是靶向治療骨骼肌萎縮的藥物。但目前僅基于體外實驗研究的結果證據力度仍較單薄，后期將繼續進行動物實驗，并在基礎實驗探究正確的情況下，進一步進行相應的臨床試驗，加強證據力度。