基于生物信息學的糖尿病腎病差異表達基因篩選和發病機制研究

李君李見王世信

在發達國家，糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）已成為慢性腎臟病（Chronic kidney disease，CKD）和腎功能衰竭（Renal failure，RF）的主要原因。在過去的二十年中，DN 的發病率和死亡率在世界范圍內迅速上升[1，2]。除健康問題，DN 還增加了患者和社會的經濟負擔。DN 進展迅速，患者能較快地發展為終末期腎病[3，4]。已有報道表明，DN的發病機制涉及代謝和血流動力學多因素的相互作用，如高血糖、腎素-血管緊張素系統和晚期糖基化終末產物[5]。但DN 的發病機制尚未完全明確，其潛在的干預靶點和途徑亟待挖掘。本研究利用生物信息學方法挖掘DN 發生和發展的潛在機制，為DN 的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 DN 差異表達基因篩選在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中檢索獲取芯片數據。下載GSE14 2153 數據集，該數據集包含23 例DN 患者（DN 組）和10 例健康對照者（對照組）的外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）的基因表達數據，實驗平臺為Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray4x44K G4112F（美國安捷倫）。利用R 語言軟件中的“limma”和“pheatmap”對GSE 142153 數據集進行標準化處理，以P<0.05、|fold change|≥2 為條件進行差異表達基因篩選和聚類分析。

1.2 DN 差異表達基因富集分析以P<0.05 為條件，利用R 語言“ClusterProfiler”數據包對篩選得到的DN 差異表達基因進行信號通路和基因本體（Gene oncology，GO）富集分析，并將富集結果可視化。

1.3 DN 差異表達基因的蛋白質相互作用（Proteinprotein interaction，PPI）網絡的構建使用STRING數據庫（https://string-db.org）“Multiple Proteins”功能，設定物種為“智人”（Homo sapiens），將DN 差異表達基因導入系統檢索，設定評分分值>0.4，隱藏獨立的靶點，構建PPI 網絡。以網絡節點度值為參考，利用Cytoscape3.7.2 軟件（http://www.cytoscape.org）中的cytoHubba 插件篩選PPI 網絡中的核心靶點[6]。

1.4 DN 差異表達基因功能聚類利用基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）方法，借助GSEA v4.1.0 軟件分析DN 差異表達基因數據，以歸一化富集得分（Normalized enrichment score，NES）絕對值>1、P<0.05、錯誤發現率（False discovery rate，FDR）<0.25 為條件篩選DN 差異表達基因富集的生物學功能[7]，了解它們在特定功能基因集中的表達狀況。

2 結果

2.1 DN 差異表達基因篩選經篩選，與正常對照組相比，DN 組樣本存在160 個差異基因，其中上調基因100 個，下調基因60 個，見表1。

表1 DN 差異表達基因

2.2 DN 差異表達基因富集分析上調的差異表達基因顯著富集于腫瘤壞死因子（TNF）、NOD 樣受體（NLR）、核轉錄因子Kappa B（NF-κB）、白細胞介素17（IL17）等信號通路上，涉及平滑肌細胞增殖等生物學功能；下調差異表達基因顯著富集在趨化因子信號通路上，涉及巨噬細胞遷移調節等生物學功能，見圖1。

圖1 DN 差異表達基因富集分析

2.3 DN 差異表達基因的PPI 網絡構建和信號通路富集分析白細胞介素6（IL6）、CXC 趨化因子配體8（CXCL8）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、白細胞介素1B（IL1B）是DN 上調差異表達基因PPI 網絡中的核心靶點；細胞表面趨化因子受體2（CCR2）、趨化因子（C-X3-C-基元）受體1（CX3CR1）是DN下調差異表達基因PPI 網絡中的核心靶點，見圖2。

圖2 DN 差異表達基因的PPI 網絡

2.4 DN 差異表達基因功能聚類DN 差異表達基因富集于血管新生、細胞凋亡、缺氧、凝血等生物學過程，見圖3。

圖3 DN 差異表達基因生物學功能富集

3 討論

DN 是最常見的慢性腎臟疾病，也是終末期腎功能衰竭的主要原因。DN 被認為是血流動力學和代謝因素相互作用的結果，其發病機制涉及多因素、多途徑，其中免疫反應和炎癥起主要作用[8]。慢性腎功能不全與腎臟炎癥有關，巨噬細胞及NF-κB 信號通路參與其中[9]。高血糖狀態可激活單核巨噬細胞系統，導致腎臟組織的巨噬細胞浸潤，誘導細胞因子釋放和單核巨噬細胞募集，最終導致炎癥反應，同時，肥大細胞等炎性相關細胞也滲入腎小管間質，釋放炎癥介質和蛋白水解酶，參與這一病理過程[10]。

NF-κB 信號通路是經典的炎性反應通路，控制著參與免疫反應和炎癥等不同過程的基因的表達。在DN 發病過程中，NF-κB 信號通路會調控腎臟結構改變和功能異常等分子和生物學途徑，如腎素-血管緊張素系統的激活、晚期糖基化終末產物的積累和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸主導的氧化應激等，處于DN 相關炎性反應的核心地位[11]。

TNF-α 在DN 發病過程中發揮重要作用，可通過影響白細胞的募集和激活，加劇DN 相關的炎癥反應。TNF-α 與兩種細胞表面受體——TNFα 受體1 和2 相互作用發揮其生物學作用，這兩種受體已被認為是一種新的預測DN 預后的生物標志物[12]。在DN 中，TNF-α 及其受體參與細胞因子、趨化因子、生長因子、細胞外基質蛋白的合成，并介導對足細胞、系膜細胞、內皮細胞和上皮細胞的多種細胞毒作用[13]。一項薈萃分析表明，2 型糖尿病患者和DN 患者血清TNF-α 濃度均增加，且DN 患者血清TNF-α 濃度高于2 型糖尿病患者[14]。

NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3)是經典的炎癥因子，活性氧誘導激活的NLRP3 參與腎損傷的發生發展。糖尿病患者體內活性氧水平升高，當NLRP3 激活時，NLRP3 可同時激活半胱氨酸蛋白酶-1（CP-1），誘導炎反應[15]。研究證實，NLRP3 在DN 大鼠腎臟中高表達，而NLRP3 炎性小體下游的IL-1 和IL-18 水平也明顯升高，提示DN 的發生和發展與NLRP3 的激活有關[16]。

IL-17A 是先天免疫的重要調節因子，主要由Th17 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞和肥大細胞產生，與多種炎癥性疾病的發病機制有關。有研究表明，IL-17A 缺乏可減輕移植腎的急慢性損傷，改善腎功能，延長移植腎存活時間[17]。但目前IL-17 在DN 中的具體作用尚未完全明確。Kim等[18]報道，通過霉酚酸酯靶向Th17 細胞減輕DN模型小鼠腎損傷，表明調節IL-17 可能是治療DN的可行方法。另有研究證實，在糖尿病大鼠模型中，用雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制劑治療可以減弱Th17 活性和腎臟損傷[19]。與上述研究結果不同，Mohamed 等[20]研究證實，IL-17A 和IL-17F 對DN有保護作用。Ma 等[21]研究也發現，IL-17 缺乏癥減弱了DN 模型小鼠促炎基因的表達，表明IL-17對鏈脲佐菌素誘導的DN 具有保護作用。

趨化因子在細胞募集和遷移中起關鍵作用，根據功能不同，趨化因子又被定義為穩態趨化因子和炎性趨化因子，其中炎性趨化因子與促炎機制有關，并誘導白細胞向受損組織募集[22]。趨化因子與DN 的發生密切相關。當間充質干細胞暴露在DN 的炎癥環境中時，可以通過釋放趨化因子來協調局部和全身的先天和適應性免疫反應[23]。在DN動物模型中，不同家族的眾多趨化因子，如CCL2、CCL20、CXCL5、CXCL7 和CXCL12，在腎小球和近端小管中增加[24，25]。

經拓撲分析，IL6、CXCL8、MMP9、IL1B 是DN上調差異表達基因PPI 網絡中的核心靶點，CCR2、CX3CR1 是DN 下調差異表達基因PPI 網絡中的核心靶點。IL-6 是一種在炎癥病理中起關鍵作用的細胞因子。一項評估IL-6 與DN 發病相關性的薈萃分析研究表明，IL-6 的等位基因，如rs1800795、rs1800796 和rs1800797 在DN 的發生和發展中有重要作用[26]。另有研究證實，DN 患者尿液中IL-6 水平升高，這一現象在腎臟預后較差的患者中尤為明顯[27]。重組人趨化因子CXCL8（IL-8）及其受體是DN 進展的主要參與者。IL-8 主要激活中性粒細胞募集并誘導氧化應激，增加DN 的血管通透性和內皮損傷[28]。在亞洲人群中，IL-8 的等位基因IL8-rs4073 與DN 的發生有很強的相關性[29]。研究表明，CXCL8 升高是導致糖尿病小鼠腎臟損傷和中性粒細胞積聚的關鍵因素，在糖尿病小鼠模型中應用CXCL8 拮抗劑（G31P），G31P 治療組腎功能障礙明顯減輕[30]。IL-1β 由巨噬細胞產生，是免疫系統中的關鍵因子，可觸發腎細胞產生其他次級促炎介質[31]。臨床研究表明，IL-1β 受體拮抗劑-阿那白滯素（Anakinra）可改善血糖和β 細胞功能，降低全身炎癥標志物[32]。另有研究表明，新的IL-1β抑制劑——利納西普（Rilonacept）降低了慢性腎臟病患者的全身炎癥反應[33]。CC 族趨化因子受體2（CCR2）參與免疫炎性反應，CC 族趨化因子配體2（CCL2）水平升高與腎小球損傷、腎臟炎癥和腎功能下降密切相關。研究表明，CCR2 拮抗劑可以降低DN 腎臟巨噬細胞的聚集和損傷[34]。實驗研究表明，阻斷CCR2 受體可以減少DN 模型小鼠蛋白尿和降低腎小球纖維化水平，恢復腎功能[35]。趨化因子受體CX3CR1 在單核細胞和循環淋巴細胞中高表達，與腎臟疾病密切相關。研究表明，CX3CR1 的配體CX3CL1 可通過特異性阻斷巨噬細胞上的CX3CR1表達，發揮減少缺血腎臟巨噬細胞的浸潤作用，減輕缺血再灌注損傷后的腎纖維化改變[36]。

GSEA 富集分析表明，DN 發病涉及血管新生、細胞凋亡、缺氧、凝血等生物學過程。Wilson 等[37]對DN 腎臟標本進行單細胞測序發現，腎小球、近曲小管、遠曲小管的細胞呈現典型的血管新生表型。Jin 等[38]研究發現，脂肪干細胞外泌體可以上調足細胞miR-486 的表達，抑制Smad1/mTOR 信號通路，減少細胞凋亡，改善DN 癥狀，表明DN 發病涉及細胞凋亡表型。腎小管缺氧是DN 早期和晚期的共同特征，DN 動物模型中，近端腎小管上皮細胞和DN 患者腎組織中缺氧誘導因子-1α 表達升高[39]。糖尿病患者的血液呈高凝狀態，可加重腎臟損傷，DN 患者活化部分凝血活酶時間縮短，提示DN 患者內源性凝血功能增強[40]。

綜上所述，與健康人群相比，DN 患者PBMCs基因表達存在顯著差異，其病理過程與TNF、NLR、NF-κB、IL-17、趨化因子等信號通路有關。IL6、CXCL8、MMP9、IL1B、CCR2、CX3CR1 是DN 發 病過程中的核心靶點。DN 病理過程涉及血管新生、細胞凋亡、缺氧、凝血等生物學過程。