基于系統虛擬藥理學與歸經理論研究歸大腸經中藥抗結直腸癌藥效物質基礎*

洪盛威，夏澤遠，陳 恒，王 皓

1 南京中醫藥大學鼓樓臨床醫學院，南京 210008；2 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 藥學部，南京210008

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床常見的癌癥類型，其在全球的發病率與致死率均逐年升高。我國CRC 的發病率為284.55/10 萬，死亡率為176.28/10 萬[1]。目前其主要治療手段是手術、化療及放療相結合的綜合治療，由于放化療技術具有副作用明顯、局部選擇性差的缺點，故對藥物治療方法進行研究仍屬熱點。

現代腫瘤靶向制劑具有選擇性高、作用效應好的優點，廣泛應用于特定腫瘤的臨床治療中。中醫歸經理論表明，藥物作用于機體有相對的趨向性，可發揮引導效應。現代藥理研究表明，中藥歸經理論與現代腫瘤靶向制劑研究觀點極為相似[2]。能否利用歸經理論縮小抗CRC 藥物的篩選范圍，尋找具有抗CRC 作用的中藥單體，值得深入研究探討。

得益于X 衍射等相關解析技術的進步，CRC 疾病相關靶點結構逐步明晰，此類靶點受體結構的分子藥物設計和藥效物質基礎研究得以迅速發展[3]。通過三維空間結構及能量匹配可預測藥物（配體）和受體之間潛在的結合模式及結合力，探討藥物和靶點間作用效應機制。該方法降低了篩選活性成分的盲目性，縮短了篩選時間，降低了研發成本，為快速篩選中藥潛在活性成分提供借鑒。

本實驗基于CRC 發病機理[4]，針對性地選擇歸大腸經中藥，從相關數據庫及文獻數據挖掘，構建該類中藥的單體數據庫；同時確定CRC 疾病相關靶點，借助于系統虛擬藥理學方法探討歸大腸經中藥單體與CRC 疾病相關靶點的結合效應，構建“活性成分-靶點-疾病” 作用效應圖，并結合CCK-8 與Western blot 進行體外驗證，為篩選中藥潛在活性成分提供參考。

1 材 料

1.1 藥物與試劑

黃連堿（批號MUST-17072010）、大黃酸（批號MUST-18031309）、蘆薈大黃素（批號MUST-18032605）、大黃素（批號MUST-17102702）、楊梅素（批號MUST-18021524）、苦杏仁苷（批號MUST-18042810）均購自成都曼思特生物科技有限公司；DMEM 培養液（批號323050011），胎牛血清（批號085150010），青霉素、鏈霉素（批號450201008）均購自維森特生物技術南京有限公司；0.25%胰蛋白酶（批號67057313）Biosharp 公司；GAPDH 兔IgG（批號0019），VEGFR2 兔IgG（批號0002）均購自美國CST 中國分公司；MMP-9 兔IgG（美國Cell Signal公司，批號11927S）；蛋白預染Marker（Thermo，批號00261899）；其他試劑均為分析純；水為純化水。

1.2 儀器

DMI3000B 倒置光學顯微鏡（德國萊卡公司）；MICRO-17R 冷凍離心機（美國Thermo 公司）；AE240 電子天平（美國梅特勒-托利多公司）；ELx800 酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；EPS300電泳電源，VE-180 垂直電泳槽，5300 凝膠成像系統（均為上海天能科技有限公司）。

1.3 細胞培養

人結腸癌細胞HCT116 細胞購自American Type Culture Collection（ATCC）。

1.4 中藥單體的分子特征計算及計算機輔助篩選

分子特性計算基于Canvas 平臺。計算機輔助篩選程序及軟件為Maestro 藥物設計平臺，包括中藥活性組分數據庫中小分子前處理優化模塊Macro-Model；活性組分基于靶點計算機輔助篩選模塊Glide；蛋白三維結構的優化、評測模塊同源模建Prime，用于蛋白靶點活性位點結合口袋搜尋及確證模塊SiteMap。以上平臺均來源于Schr?dinger 公司。CRC 靶點選自GeneGo 公司系統虛擬藥理學平臺MetaDrug。

2 方 法

2.1 歸大腸經中藥單體數據庫

收集常用中藥[5]，獲得大黃、烏梅、甘遂等歸大腸經中藥共85 味。基于傳統中藥系統藥理學數據庫（TCMSP）、中國中藥整合數據庫（TCMID），并結合相關文獻數據挖掘，收集上述85 味歸大腸經中藥所含中藥單體2925 個。從Pubchem 數據庫中獲得上述中藥單體的分子結構、相對分子量、分子式等信息，建立歸大腸經中藥單體數據庫。之后，使用MacroModel[6]模塊對每個化合物進行處理，選擇OPLS_2005 力場和TNCG 進行結構優化，優化時能量閾值設定為0.5 kJ·nm-1·mol-1，目的是使均方根偏差（RMSD）變化盡可能小[7]。

2.2 CRC 疾病相關靶點的選擇

對CRC 相關信號通路領域的文獻報道進行歸納總結[8]。采用GeneGo 公司MetaDrug 模塊，選擇CRC 靶點。通過對靶點相關的配體、蛋白信息的判別，最終確定了10 個與CRC 疾病相關的靶點。

2.3 中藥單體分子特性計算及計算機輔助篩選

將2925 個歸大腸經中藥單體裝載到Schr?dinger（2018）平臺的Canvas 模塊，對9 個關鍵分子描述符進行計算，包括原子的LogP、電拓撲狀態、氫鍵受體數、氫鍵供體數、摩爾折射率、分子量、極性表面積、Miller 極化值、可旋轉鍵數，涉及物理化學、拓撲等多個方面的信息。根據相關數據庫及文獻報道，確定CRC 疾病相關靶點，其蛋白結構均從RSCD PDB 數據庫獲取，選用Maestro 藥物設計平臺的計算機輔助篩選模塊Glide；本研究的篩選程序如下：將每個CRC 疾病相關靶點導入平臺，進行加氫原子、去除水分子、處理重原子、調整鍵序等前處理，選用OPLS_2005 力場進行能量最小化優化處理，直到非氫原子的均平方根偏差（root-meansquare deviation，RMSD）減小為3 nm。接著，采用Glide 對接模塊下receptor grid generation 面板產生活性位點結合口袋，以各個蛋白自帶配體為中心、生成活性格點盒子；其中蛋白和配體間范圍設置為1.0/0.8；精度方面選擇標準精度，每個配體均對接10 次，最后取總平均值，進行歸大腸經的中藥單體基于CRC 靶點的計算機輔助篩選研究。最后，記錄輔助篩選評價打分指標如對接得分、范德華力、結合能、氫鍵指標等，并按照總對接得分從高到低依次排序，以評價各中藥單體與CRC 靶點間的結合效應。

2.4 “活性成分-靶點-疾病”網絡構建與分析

依據計算機輔助篩選結果，以CRC 靶點蛋白自帶配體的對接評分為閾值，得分高于閾值的中藥單體即判定具有活性，選取前30 個成分與相應的靶蛋白導入Cytoscape3.7.1 網絡分析軟件，構建“活性成分-靶點-疾病”網絡，其中單體、靶點、疾病用節點表示，三者間的相互關系用邊表示，最后選用Cytoscape3.7.1 的Network Analyzer 插件分析“活性成分-靶點-疾病”網絡特征。

2.5 HCT116 細胞的培養及分組

復蘇HCT116 細胞株，當細胞長至80%亞融合狀態時，棄去原培養液，PBS 蕩洗2 次，胰酶消化，棄消化液，PBS 蕩洗2 次，加適量含10%胎牛血清的DMEM 完全培養液，吹打成單個懸浮細胞，分成4 瓶，繼續培養。用4～6 代HCT116 細胞、生長融合后，胰蛋白酶消化、吹打成單個懸浮細胞，用于后續實驗。分組為：對照組、給藥組（50 μg·mL-1）。藥物用DMEM 培養液稀釋，進行藥物干預前，棄去原培養液。

2.6 CCK-8 法檢測細胞活性

借助CCK-8 法檢測篩選出的前6 個中藥單體對HCT116 細胞活性的影響。懸浮細胞計數板計數，之后用DMEM 培養液稀釋細胞，并將密度調整至1×105個·mL-1，將該濃度的細胞接種于96 孔板中，每孔100 μL，每組設置10 個復孔，共7 組，24 h細胞孵育貼壁后，棄去原培養液，各組加入對應藥物100 μL，對照組加入DMEM 培養液100 μL，培養24 h，之后每孔加入CCK-8 試劑10 μL，繼續培養4 h后，使用酶標儀在450 nm 波長處測定吸光值（OD）。將對照組細胞存活率定義為100%，細胞活性按公式計算：細胞活性=（試驗組OD 值/對照組OD 值）l00%。

2.7 Western blot 檢測VEGFR2、MMP-9 蛋白水平

為證明篩選策略的可靠性、準確性，本研究選取VEGFR2、MMP-9 進行Western blot 實驗驗 證，研究篩選結果中前6 個中藥單體對HCT116 細胞VEGFR2、MMP-9 蛋白表達的影響。計數板計數懸浮細胞，用DMEM 培養液稀釋細胞，并將密度調整至2.5×105個·mL-1，將該濃度的細胞接種于6 孔板中，每孔2 mL，每組設3 個復孔，共7 組，24 h 細胞孵育貼壁后，棄去原培養液，各組加入對應藥物2 mL，對照組加入DMEM 培養液2 mL，培養24 h 后，胰蛋白酶消化細胞，收集各組細胞至新的EP 管內。Western blot 裂解液冰上裂解細胞30 min，4 ℃下12 000 r·min-1離心5 min，收集上清液，Bradford 法進行蛋白定量。加入上樣緩沖液并煮沸蛋白10 min，取50 μg 總蛋白作SDS-PAGE 電泳，將蛋白轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，按照分子量的大小將PVDF 膜剪開，使內參GAPDH 與目的基因分開，之后分別孵育GAPDH（1∶5000）、VEGFR2（1∶1000）、MMP-9（1∶500）抗體，4 ℃孵育過夜，以TBST 清洗PVDF 膜3 次，每次10 min，之后以對應的二抗（1∶10000）孵育2 h，以TBST 清洗PVDF 膜3次，每次10 min，采用凝膠成像系統化學發光成像。

2.8 統計學處理

Western blot 數據采用Quatity one 軟件進行灰度值的統計，計量數據以均數±標準差（）表示，數據結果采用GraphPad Prism 6.0 軟件進行方差分析并作圖。多組間的比較采用單因素方差分析，組間比較采用t 檢驗。P<0.05 為有統計學意義。

3 結果

3.1 歸大腸經中藥單體的分子特征

采用Canvas 模塊對歸大腸經的中藥單體分子描述符進行計算，結果見表1。中藥化學成分數量眾多，結構類型各異。本研究共研究了85 味中藥中共計2925 個單體，表1 顯示，統計的描述符數據中極性表面積等指標SD 與均數相近，甚至大于均數，離散度大。該統計結果表明，本研究構建的歸大腸經的中藥單體數據庫具有較好的結構多樣性分子特征。

表1 歸大腸經中藥單體的關鍵描述符特征

3.2 靶點選擇

通過對CRC 靶點網絡進行系統研究分析，確證了10 個CRC 類疾病相關的作用靶點，分別為：基質金屬蛋白酶3（MMP-3）、表皮生長因子受體（EGFR）、血管內皮細胞生長因子受體2（VEGFR2）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、甲狀腺素轉運蛋白（TTHY）、前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2）、血小板源性生長因子受體α（PDGFRα）、成纖維細胞生長因子受體4（FGFR4）、酪氨酸蛋白激酶ABL1（ABL1）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14），詳細信息見表2，并在此基礎上考察中藥單體與CRC 靶點間的作用效應。

表2 CRC 疾病相關靶點

3.3 與蛋白多靶點作用效果較好小分子化學結構

本研究篩選了2925 個中藥單體與10 個CRC相關靶點之間的結合效應，限于篇幅，未能將每個單體與對應靶點的結構效應一一列出，僅選出與4個及以上靶點有作用效應的中藥單體，共計30 個，見圖1。篩選出的中藥單體從結構上屬于黃酮類、香豆素類、蒽醌類、木脂素類、苯甲酸類、糖苷類、酚類、脂肪酸類、生物堿類等化合物。對85 個歸大腸經中藥與30 個分子的相關性進行分析，排名前5的中藥分別為：老鸛草（7/30）、馬齒莧（6/30）、敗醬草（6/30）、澤漆（6/30）、委陵菜（6/30），其中有7 個中藥單體來自老鸛草，占較大權重（7/30），分別為（5）楊梅素、（11）鞣花酸、（17）金絲桃苷、（24）槲皮素、（25）蘆丁、（26）山奈酚、（29）木犀草素。

圖1 篩選出的前30 個中藥單體的分子結構信息

表3 列舉了與4 個及以上CRC 靶點存在較好結合效應的30 個中藥單體，包括：（1）黃連堿、（2）大黃酸、（3）蘆薈大黃素、（4）大黃素、（5）楊梅素、（6）苦杏仁苷、（7）千層紙素A、（8）咖啡酸、（9）巴豆酸、（10）大黃酚、（11）鞣花酸、（12）漢黃芩素、（13）丁香酸、（14）瑞枯靈、（15）辛夷脂素、（16）小檗堿、（17）金絲桃苷、（18）檜黃素、（19）丁香酚、（20）香豆素、（21）芹菜素、（22）香葉木素、（23）蒙花苷、（24）槲皮素、（25）蘆丁、（26）山奈酚、（27）芫花素、（28）異鼠李素、（29）木犀草素、（30）大黃素甲醚。

表3 前30 個與CRC 靶點結合效應較好中藥單體的多靶點效應

3.4 “活性成分-靶點-疾病”網絡效應

以“活性成分-靶點-疾病”網絡層次分析可以提供生物網絡的一般特征，亦可計算節點的拓撲學特征，此方法有助于從復雜生物網絡中獲得潛在的生物信息。如圖2 所示，“活性成分-靶點-疾病”網絡表明，中藥既存在單個成分與多個靶點的相互作用，同時也存在不同成分作用于同一個靶點的現象，該結果初步闡明了中藥多成分多靶點的作用特點。通過Network Analyzer 插件計算網絡模型的重要參數，常見的網絡參數有節點數（number of nodes）、網絡密度（network density）、網絡異質性（network heterogeneity）、網絡中心度（network centralization）等[9]。網絡分析數據結果顯示：直徑為3，半徑為2，中心度為0.530，密度為0.240，節點數為41，異質性為0.718。

圖2 中藥抗CRC“活性成分-靶點-疾病”網絡特征效應圖

3.5 篩選出的前6 個中藥單體對HCT116 細胞活性的影響

由CCK-8 結果顯示，與對照組相比，給予黃連堿、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、楊梅素、苦杏仁苷（50 μg·mL-1）后，各組細胞存活率顯著降低（P<0.05），說明通過計算機輔助篩選出的前6 個中藥單體對HCT116 細胞活性具有一定的抑制作用，其細胞活性（相比對照組）分別為100.00±6.23、69.11±8.12、82.33 ±5.23、75.23 ±6.25、78.55 ±4.63、71.66 ±6.65、83.79±7.78。

3.6 篩選出的前6 個中藥單體對HCT116 細胞VEGFR2、MMP-9 蛋白表達的影響

Western blot 結果顯示，與對照組比較，黃連堿、大黃素、楊梅素、苦杏仁苷組HCT116 細胞中VEGFR2、MMP-9 蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）；大黃酸組HCT116 細胞中VEGFR2 蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）；蘆薈大黃素組HCT116 細胞中MMP-9 蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），該結果表明，黃連堿、大黃素、楊梅素、苦杏仁苷可以同時抑制HCT116 細胞中MMP-9 和VEGFR2 蛋白的表達；大黃酸可以抑制HCT116 細胞中VEGFR2 蛋白的表達，蘆薈大黃素可以抑制HCT116 細胞中MMP-9 蛋白的表達，結果見圖3。以上結果與計算機輔助篩選結果完全一致，這在一定程度上驗證了本策略的可靠性、準確性。

圖3 HCT116 細胞中VEGFR2、MMP-9 蛋白表達水平

4 討論

臨床上多數疾病的發病機理較為復雜，涉及多基因、多靶點通路和網絡調控。西藥的開發基本是基于“一藥物、一靶點、一疾病”的研發模式，該方法看重藥物與靶點之間作用的特異性而忽略了人體各系統之間的平衡關系。雖然一些針對腫瘤分子遺傳學改變開發的抗腫瘤新藥已在臨床使用，并顯示出良好的臨床應用前景；但其只針對部分特定類型的腫瘤患者才能發揮療效，并存在一定的不良反應。中藥是中醫防病治病的主要手段，是天然組合化學庫，化合物數量巨大。大量文獻報道表明，許多中藥復方、單味中藥在CRC 治療方面可發揮明顯作用，同時具有副作用小、易于取材的優點[10]；但其作用機制及活性成分不明確的問題成為開發中藥新藥的瓶頸，如何從中藥中篩選出活性成分對于中藥的發展至關重要。

歸經是指中藥對某臟腑經絡的選擇特性，是中藥藥性理論的重要組成部分，中醫歸經理論的運用是中醫學的特色之一，其實質是宏觀的靶向思維。在中醫藥腫瘤治療的臨床實踐中，已有學者總結了歸經理論用于腫瘤中藥治療的經驗，如腦腫瘤用蟲類藥僵蠶、全蝎；食管癌用硼砂、硇砂；甲狀腺癌用白芥子、僵蠶；肺癌用桔梗、白果；胃癌用半枝蓮、白術；肝癌用柴胡、青皮、陳皮；直腸癌用苦參等[11]。從歸大腸經中藥中尋找抗CRC 有效成分，可有效縮小抗癌藥物的篩選范圍，提高篩選的靶向性。系統虛擬藥理學是利用分子對接技術研究小分子配體與生物大分子受體間的相互作用，預測其結合模式，進而實現基于結構的藥物設計?；谂潴w與受體作用的鎖匙原理，分子對接可較為準確地預測與靶受體活性部位空間和電性特征相匹配的小分子化合物，目前已在天然藥物開發中被廣泛使用。將系統虛擬藥理學與歸經理論用于中藥新藥的開發，探索一種中醫歸經理論指導下的，快速篩選中藥活性成分的方法，對于研究中藥藥效物質基礎及闡明其作用機制具有重要意義。

本研究將2925 個歸大腸經中藥單體與10 個CRC 相關靶點進行對接，篩選出其中與4 個及以上靶點有作用的中藥單體，共計30 個，結構上屬于黃酮類、香豆素類、蒽醌類等，其中除（9）巴豆酸、（14）瑞枯靈、（15）辛夷脂素、（17）金絲桃苷、（23）蒙花苷共5 個中藥單體未見抗CRC 相關報道外，其余25個單體均有文獻報道，其藥理作用主要體現在抗增殖、誘導凋亡、誘導細胞周期阻滯、抑制血管生成和轉移、抗氧化、抗炎以及化學防御等方面。研究篩選出的與30 個候選中藥單體相關度最高的是歸大腸經中藥——老鸛草，具有抑制CRC 細胞增殖的藥效，其作用機制可能與誘導腫瘤細胞凋亡有關[12]。此后，為證明篩選策略的可靠性、準確性，借助CCK-8檢測前6 個中藥單體對HCT116 細胞活性的影響，并抽取VEGFR2、MMP-9 這兩個靶點進行機制層面的驗證，抽取VEGFR2、MMP-9 進行實驗驗證的原因如下：（1）本研究創新點在于探索一種中醫歸經理論指導下的、快速篩選歸大腸經中藥治療CRC 活性成分的方法，進行靶點驗證的目的是證明篩選策略的可靠性、準確性，即證實篩選出的成分確有抗腫瘤活性，并非為了發現新的靶點，故抽取了2 個靶點進行了初步驗證；（2）本課題組前期做過VEGFR2、MMP-9 的相關研究[13，14]，方法較為成熟，因此對這兩個靶點先進行初步驗證。為進一步驗證篩選出的30 個潛在活性成分的準確性，后期將繼續對剩余8 個靶點進行驗證，并深入探究活性成分的抗腫瘤機制。

本研究基于中醫歸經理論，應用系統虛擬藥理學，建立一種快速、靶向明確的篩選中藥活性成分新方法，初步闡明了歸經理論在藥物篩選中的指導價值，為快速篩選中藥抗腫瘤活性成分研究提供新思路。研究篩選出的30 個候選活性化合物，后續可憑借藥物化學手段進行結構修飾或改造，最終為單用或聯合用藥提供更多的藥物來源。