苦參堿對HCCLM3 人高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞體外轉(zhuǎn)移的作用及機制研究

席 昱，汪瑞辰，周宋匯

江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇省腫瘤防治研究所，南京醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，南京210009

隨著生活環(huán)境和飲食習慣的改變，惡性腫瘤的發(fā)病率逐年增高，盡管診療策略和臨床技術的不斷提高，但是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移依然是致死的主要因素[1]。肝癌是一種常見的惡性腫瘤，其致死人數(shù)僅次于肺癌，嚴重影響了人們的生命健康安全[2]。目前，盡管對于早期肝癌可以通過手術切除、輔以全身化療的策略以提高患者生存期；但是，在肝癌的診斷過程中，早期肝癌的診斷率極低，同時肝癌細胞又具極強的轉(zhuǎn)移能力，很多患者在確診時已經(jīng)處于肝癌的中晚期并伴隨著肝癌細胞的轉(zhuǎn)移，大大縮短了患者的生存期。目前靶向制劑索拉菲尼依然是轉(zhuǎn)移性肝癌治療的一線用藥[3]，盡管其在一定程度上提高了轉(zhuǎn)移性肝癌患者的總體生存質(zhì)量；但是索拉菲尼存在厭食、疲勞以及消化道方面的不良反應，嚴重影響了藥物治療的有效性，導致治療的失敗。因此，研發(fā)高效、低毒、價廉的抗肝癌轉(zhuǎn)移藥物是當前肝癌治療的難點和重點。

當前研究表明，腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肝癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要方式[4]，在EMT 過程中，腫瘤細胞由上皮樣轉(zhuǎn)變成為間質(zhì)樣，細胞的運動能力、侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著增加。同時，在癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的過程中需要分泌較多的細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloprotinase，MMP），以降解堅硬的細胞外基質(zhì)，實現(xiàn)癌細胞遠處轉(zhuǎn)移和侵襲，其中MMP-2 和MMP-9 是要降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶[5,6]，因而也是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的重要靶標。

苦參堿是中藥苦參中的主要活性成分，研究已經(jīng)表明其具有一定的抗病毒和抗多種腫瘤的藥理學特性[7]。基于此，本研究利用HCCLM3 人高轉(zhuǎn)移性的肝癌細胞，探求苦參堿體外抗肝癌細胞轉(zhuǎn)移的作用及機制，以期為藥物研究和臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細胞株

人肝癌高轉(zhuǎn)移細胞株HCCLM3，購自于武漢Procell 生命科技有限公司。該癌細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中。

1.2 藥品與試劑

苦參堿（純度≥98%，批號：M109843）購自阿拉丁試劑（上海）公司；DMEM 培養(yǎng)基（批號：20200418）購自江蘇凱基生物公司；胎牛血清（批號：H2319）購自美國Hyclone；Matrigel 基底膠（批號：6439228）購自美國BD 公司；瑞氏-吉姆薩染色液（批號：205347）購自武漢塞維爾生物科技公司；E-cadherin（E-鈣粘蛋白，20874-1-AP）、N-cadherin（N-鈣粘蛋白，22018-1-AP）、Vimentin（波形蛋白，10366-1-AP）蛋白一抗、蛋白二抗均購自于武漢Proteintech生物技術公司；MMP -2（ab97779），MMP -9（ab228402）蛋白一抗均購自美國Abcam 公司；其余試劑均為分析純。

1.3 實驗儀器

分析天平，BSA224S 型，購自德國賽多利斯公司；多功能酶標儀，型號Multiskan Fc，購自美國Thermo 公司；蛋白凝膠成像系統(tǒng)，型號GelDoc 2000，購自美國Bio-RAD 公司；倒置顯微鏡，型號Axio Observer，購自德國Zeiss 公司。

2 實驗方法

2.1 CCK-8 細胞增殖實驗檢測苦參堿對HCCLM3 癌細胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的HCCLM3 癌細胞，經(jīng)胰酶消化后，細胞培養(yǎng)基重懸細胞計數(shù)加入96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔的細胞數(shù)為1×104個，加入200 μL 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。棄去培養(yǎng)基，分別加入預先配制好的0、4、8、16、32、64、128 mg·mL-1的苦參堿含藥培養(yǎng)基于設定的細胞孔中，每個劑量組設置6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 和48 h。待藥物作用完畢，小心吸去培養(yǎng)基，重新更換新的培養(yǎng)基后每個細胞孔中加入10 μL 的CCK-8 溶液，充分混勻，繼續(xù)將細胞培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。待培養(yǎng)板孵育結(jié)束后，取出培養(yǎng)板置于酶標儀中檢測450 nm 波長處的吸光度值A450。計算細胞增殖抑制率。

抑制率（%）=（1-A藥物組/A對照組）×100%。

2.2 細胞劃痕檢測苦參堿對HCCLM3 癌細胞遷移的影響

取對數(shù)生長期的HCCLM3 癌細胞，經(jīng)胰酶消化，培養(yǎng)基重懸后接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種的細胞數(shù)量為4×105個。將細胞培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，Marker 筆進行標記后，采用白色10 μL 移液器槍頭沿孔板中線進行垂直劃痕，PBS 洗滌兩次后置于顯微鏡下觀察，分設4 組：苦參堿0、4、8、16 mg·mL-1組，每組設置6 個復孔，分別加入2 mL 含有藥物的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后于顯微鏡下觀察，并進行拍照（×100 倍）。

細胞遷移率（%）=（劃痕寬度1～24h/劃痕寬度0h 時間點）×100%。

2.3 Transwell 小室檢測苦參堿對HCCLM3 癌細胞侵襲的影響

于實驗前一天在Transwell 小室的上室，采用培養(yǎng)基4 倍稀釋的Matrigel 膠，均勻鋪被完成后將整個小室置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使該膠充分凝固。將5×103個HCCLM3 癌細胞種植于上室，上室的培養(yǎng)體系為100 μL 的含藥培養(yǎng)基。實驗分設4組：苦參堿0、4、8、16 mg·mL-1組，每組設置6 個平行復孔。Transwell 小室下室加入含有20%小牛血清的完全培養(yǎng)基，將整個小室置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。待藥物作用結(jié)束后，采用棉簽輕輕將未侵襲的細胞刮去，以PBS 洗滌2 次，4%多聚甲醛充分固定15 min，PBS 洗去固定液，參照瑞氏吉姆薩染色液實驗方法進行染色后，將上室底部的膜剪下貼于載玻片上，顯微鏡下隨機選取5 個視野進行拍照，計數(shù)視野的平均的侵襲細胞數(shù)量。

2.4 RT-PCR 檢測HCCLM3 癌細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 和MMP-9基因mRNA 的表達

取對數(shù)生長期的HCCLM3 癌細胞，經(jīng)胰酶消化后進行計數(shù)，接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種數(shù)量為2×105個，接種完畢后補充培養(yǎng)基，調(diào)整整個培養(yǎng)體系為2 mL，細胞培養(yǎng)過夜，待細胞完全貼壁后小心吸去培養(yǎng)基，實驗分設4 組：苦參堿0、4、8、16 mg·mL-1組，每組設置6 個復孔，加入相應的含藥培養(yǎng)基，待藥物作用24 h 后，小心棄去培養(yǎng)基，采用無菌PBS 清洗細胞孔3 遍，加入Trizol 充分提取細胞中的全部RNA，采用Nanodrop 計算RNA 含量，以500 ng 總RNA 為模板，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄為相應的cDNA，加入cDNA 和相應的擴增試劑，置于實時定量PCR 儀中進行RT-PCR 檢測。以GAPDH 作為內(nèi)參基因，實驗結(jié)果以2-△△Ct法計算基因的相對表達量。實驗所用引物由上海生工生物公司進行合成，引物序列如下：

E-cadherin：F：5’-ACTACCTTGCCCTGCTAAT-3’；R：5’ -TCTACGCTATCTGGGACTACTT -3’；N -cadherin：F：5’ -GTGCGATTAGCCAATTCAGC -3’；R：5’-GCACTCGAATCCCTAGGAGG-3’；Vimentin：F：F：5’-CGCTTCGCCAACTACAAATC；R：5’-AGCCCATCCACTTCTTACAG-3’；MMP-2：F：5’-ATCAACCAACCTTGACCAA-3’；R：5’-TCAGAGACCGACCCTACAA -3’；MMP -9：F：5’ -GACTCGGTCTTTGAGGAGCC-3’；R：5’-GAACTCACGCGCCAGTAGAA-3’；GAPDH:F：5’-GTCGCCAGCCGAGCCACATC-3’；R：5’-CCAGGCGCCCAATACGACCA-3’。

2.5 Western Blot 法檢測HCCLM3 癌細胞Ecadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 和MMP-9蛋白表達

取對數(shù)生長期的HCCLM3 癌細胞，經(jīng)胰酶消化后進行計數(shù)，接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種2×105個，然后補充培養(yǎng)基，調(diào)整整個培養(yǎng)體系為2 mL，細胞培養(yǎng)過夜，待細胞完全貼壁后小心吸去培養(yǎng)基，實驗分設4 組：苦參堿0、4、8、16 mg·mL-1組，加入相應的含藥培養(yǎng)基，待藥物作用24 h 后棄去培養(yǎng)基，采用無菌PBS 清洗細胞孔3 遍，胰酶消化收集全部癌細胞，加入細胞蛋白裂解液后超聲破碎細胞，充分使細胞裂解提取全部蛋白，采用NanoDrop儀器檢測蛋白含量，將蛋白樣品與上樣緩沖液按比例充分混勻后制備蛋白樣品，制備完畢后按照每孔50 μg 進行上樣，并進行SDS-PAGE 蛋白凝膠電泳。然后作蛋白轉(zhuǎn)膜，PVDF 膜經(jīng)脫脂奶粉封閉后，加入蛋白一抗置于4 ℃冰箱中過夜孵育。第二天吸去蛋白一抗，洗膜后加入蛋白二抗，室溫孵育1.5 h，TBST充分洗膜，將膜置于凝膠成像系統(tǒng)中進行曝光拍照，使用ImageJ 軟件對條帶進行灰度分析。以苦參堿0 mg·mL-1組目標蛋白灰度值計算蛋白相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計并作單因素方差分析，采用Student-Newman-Keuls post hoc 檢驗作組間比較，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。實驗圖片采用Graph Pad 5.0 進行作圖。

3 結(jié)果

3.1 苦參堿對HCCLM3 癌細胞增殖的影響

細胞增殖CCK-8 實驗結(jié)果顯示，苦參堿在32、64、128mg·mL-1劑量下，對HCCLM3 癌細胞增殖有明顯抑制作用，且與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。而在苦參堿4、8、16 mg·mL-1劑量下對HCCLM3 癌細胞的增殖并不產(chǎn)生抑制作用（P>0.05），見圖1。基于這一實驗結(jié)果，選取4、8、16 mg·mL-1劑量用于苦參堿對HCCLM3 癌細胞遷移侵襲的作用及機制研究。

3.2 苦參堿對HCCLM3 癌細胞遷移的影響

鑒于HCCLM3 癌細胞的遷移能力較強，實驗均考察藥物作用24h 的遷移和侵襲能力。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，苦參堿4、8、16mg·mL-1劑量能夠明顯減少HCCLM3 細胞的遷移距離并呈現(xiàn)出一定劑量依賴性，且與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2。

實驗結(jié)果表明，苦參堿具有較強的抑制HCCLM3癌細胞的遷移能力，進一步采用transwell 實驗對其侵襲作用進行研究。

3.3 苦參堿對HCCLM3 癌細胞侵襲的影響

Transwell 小室實驗結(jié)果顯示，在苦參堿4、8、16 mg·mL-1劑量下，HCCLM3 癌細胞侵襲數(shù)量明顯減少并具有一定劑量依賴性，且與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖3。結(jié)果表明，苦參堿能夠抑制HCCLM3 癌細胞的侵襲。

圖3 苦參堿對HCCLM3 癌細胞Transwell 小室侵襲的影響（，n=6）

3.4 苦參堿對HCCLM3 癌細胞E-cadherin、Ncadherin、Vimentin、MMP-2 和MMP-9 基因mRNA表達的影響

有關研究表明，癌細胞的EMT 是其侵襲和轉(zhuǎn)移的重要過程[8]，與此同時癌細胞為穿透堅硬的細胞外基質(zhì)還需分泌MMP-2、MMP-9 等多種基質(zhì)蛋白酶，實現(xiàn)細胞外基質(zhì)的降解，促進發(fā)生EMT 的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。對此采用RT-PCR 對腫瘤細胞EMT 過程中的 E -cadherin、N -cadherin、Vimentin 以 及MMP-2、MMP-9 因子mRNA 的表達水平進行檢測。RT-PCR 實驗結(jié)果顯示，在苦參堿8、16 mg·mL-1劑量下，能夠明顯降低HCCLM3 癌細胞中N-cadherin、Vimentin 以 及MMP-2、MMP-9 因 子mRNA水平，并升高E-cadherin mRNA 水平，且與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖4。

圖4 苦參堿對HCCLM3 癌細胞E-cadhein、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 和MMP-9 mRNA 表達的影響（，n=6）

3.5 苦參堿對HCCLM3 癌細胞E-cadherin、Ncadherin、Vimentin、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達的影響

采用Western Blot 實驗對癌細胞中的轉(zhuǎn)移相關的蛋白水平進行檢測，結(jié)果表明，苦參堿在4、8、16 mg·mL-1劑量下能明顯降低HCCLM3 癌細胞中Ncadherin、Vimentin 以及MMP-2、MMP-9 蛋白水平，并升高E-cadherin 蛋白的水平，且與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖5。實驗表明，苦參堿可能通過抑制EMT 過程關鍵蛋白及MMP-2、MMP-9蛋白發(fā)揮抗HCCLM3 癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲作用。

圖5 苦參堿對HCCLM3 癌細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達的影響（，n=3）

4 討論

苦參堿是中藥苦參的主要活性成分，當前臨床已經(jīng)開發(fā)出苦參堿注射液用于肝炎的治療[9]，同時實驗研究已表明，苦參堿注射液具有良好的抗腫瘤效應，與化療藥物聯(lián)合應用治療結(jié)直腸癌能夠提高化療藥物的抗腫瘤效應，并減少化療藥物的毒副作用[10]，改善患者的生存質(zhì)量。此外，研究也表明，苦參堿體外能夠劑量依賴性抑制人肝癌細胞HepG2 的增殖等惡性生物學行為，其機制可能與誘導氧化應激和端粒酶活性有關[11]。這些研究表明，苦參堿具有一定的抗肝癌細胞增殖的活性；但是其對于高轉(zhuǎn)移的肝癌細胞轉(zhuǎn)移作用及機制尚不清晰。因此，本研究對苦參堿抗HCCLM3 人高轉(zhuǎn)移肝癌細胞轉(zhuǎn)移的作用及機制進行了研究。

本研究表明，苦參堿在32、64、128 mg·mL-1濃度下，能夠劑量依賴性的抑制HCCLM3 癌細胞的增殖；接著選擇對腫瘤細胞非直接殺傷的4、8、16 mg·mL-1劑量、研究其對HCCLM3 癌細胞遷移和侵襲能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦參堿能夠劑量依賴性的抑制癌細胞劃痕愈合和Transwell 小室癌細胞的侵襲。EMT 過程是癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲的作用方式，因而進一步采用RT-PCR 和Western Blot 對HCCLM3 癌細胞在EMT 過程中的關鍵因子E-cadherin、N-cadherin和Vimentin 的表達水平進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦參堿在4、8、16 mg·mL-1劑量下能夠劑量依賴性的減少HCCLM3 癌細胞N-cadherin 和Vimentin 因子mRNA 和蛋白水平，升高E-cadherin 因子mRNA 和蛋白水平，表明苦參堿能夠抑制HCCLM3 癌細胞的EMT 過程，發(fā)揮抗癌細胞轉(zhuǎn)移的作用。基質(zhì)金屬蛋白酶是腫瘤細胞分泌較多、能夠降解ECM 的蛋白酶，癌細胞能夠通過分泌MMP-2 和MMP-9 降解堅硬的細胞外基質(zhì)，為癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲掃除障礙，因而MMP-2 和MMP-9 也是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的重要靶標[12，13]。因此，本研究對這兩個因子的mRNA 和蛋白水平進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦參堿在4、8、16 mg·mL-1劑量下能夠劑量依賴性的減少HCCLM3 癌細胞MMP-2、MMP-9 因子mRNA 和蛋白水平。這表明苦參堿可能通過抑制MMP-2、MMP-9 表達，以及腫瘤細胞EMT 過程，發(fā)揮抗HCCLM3 人肝癌高轉(zhuǎn)移細胞的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，苦參堿能夠抑制人肝癌高轉(zhuǎn)移HCCLM3 細胞的增殖、遷移和侵襲，其抑制HCCLM3癌細胞轉(zhuǎn)移侵襲的作用機制可能是與抑制細胞MMP-2、MMP-9 基質(zhì)蛋白酶相關因子及EMT 過程有關。實驗將進一步通過基因敲除的方式研究苦參堿的作用靶點，為苦參堿后續(xù)的抗肝癌轉(zhuǎn)移實驗和臨床研究提供依據(jù)。