天天膠囊的安全性評價

石高峰，夏建偉，蔣翠花，張東建，殷志琦，張 健*

1 南京中醫(yī)藥大學 第三臨床醫(yī)學院，南京 210028；2 江蘇省中醫(yī)藥研究院 轉化醫(yī)學實驗室，南京 210028；3 中國藥科大學 中藥學院中藥制劑系，南京210009

便秘是一種慢性、復雜的胃腸道疾病，主要癥狀是糞便較干結、糞便量減少、排便次數(shù)減少、排便較費力、排便時間延長等。便秘的反復發(fā)作嚴重影響患者的生活質量。目前治療便秘的藥物有刺激性瀉藥、容積性瀉藥、滲透性瀉藥和促動力瀉藥等；但長期使用往往會引起腹痛、腹瀉、水電解質紊亂和耐藥性等。因此，安全性較高，具有良好通便功能的藥品、保健品受到便秘患者的青睞。

天天膠囊作為一種具有通便作用的功能性物品，主要由蘆薈、南瓜、低聚木糖、茯苓和銀耳組成。以往研究證明，該品通過促進腸液分泌和改善胃腸動力緩解了洛哌丁胺誘導的大鼠便秘癥狀[1]。然而據(jù)文獻報道，長期、大劑量服用含有蒽醌成分的蘆薈可能會造成結腸黑變[2]，降低胃腸道傳輸功能[3]，甚至導致肝腎毒性[4]或誘發(fā)腸癌[5]。由于蘆薈這些潛在的毒副作用，使得含有蘆薈產(chǎn)品的安全性常常受到質疑。

本實驗分別灌胃天天膠囊和蘆薈粉13 周和26周觀察大鼠血液學變化、胃腸傳輸功能、結腸黑變情況和肝腎毒性，探究前者長期使用的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

天天膠囊（批號：20180923），蘆薈（批號：20180120）均為河北御芝林藥業(yè)提供；羧甲基纖維素鈉（上海阿拉丁生化科技公司）；硫酸鋇（青島東風化工公司）；異氟烷（北京吉安德爾科技公司）；MUC2酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技公司）。

Opera t90fpe X 線數(shù)字胃腸機（意大利GMM 公司）；SynergyH1 全波長多功能酶標儀（美國BioTek公司）；Allera64R 超速控溫離心機（美國Beckman Coulter 公司）；Axio Observer 熒光倒置顯微鏡（德國Carl zeiss 公司）；BC-2800Vet 全自動動物血細胞分析儀（深圳邁瑞公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物的配制分別準確稱量天天膠囊內(nèi)容物和蘆薈葉細粉，用0.3% CMC-Na 配制所需濃度的混懸液。稱取硫酸鋇粉末適量，用生理鹽水配制15%的鋇餐混懸液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。上述藥物均置4 ℃冰箱保存。

1.2.2 動物分組和給藥SPF 級SD 大鼠100 只，雄性，160～180 g，5 周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心，飼養(yǎng)條件：12 h 光照、12 h 黑夜交替循環(huán)，溫度為（24±2）℃，相對濕度（60±10）%，所有動物自由飲水和進食。動物實驗方案經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院倫理委員會審核并批準,倫理審批號：AEWC-025。

適應性喂養(yǎng)一周，將大鼠分為13 周和26 周兩個大組，每組50 只；每大組再按體重隨機分為5 組，每組10 只，分別為空白組（Blank）：每天灌胃給予0.3% CMC-Na 溶液；蘆薈低劑量組（ALD）與高劑量組（AHD）：每天分別灌胃給予27 mg·kg-1與108 mg·kg-1的蘆薈粉混懸液；天天膠囊低劑量組（TCLD）與高劑量組（TCHD）：每天分別灌胃給予108 mg·kg-1與432 mg·kg-1的天天膠囊內(nèi)容物粉末混懸液。給藥體積為10 mL·kg-1，連續(xù)給藥13 周和26 周。天天膠囊給藥劑量分別是臨床1 粒服藥劑量的3 倍和12倍，蘆薈的給藥劑量則是天天膠囊劑量的25%。

每日觀察并記錄大鼠的進食量、日常活動情況、精神狀態(tài)、毛發(fā)顏色等。每周稱量大鼠的體重并記錄。給藥后，每周統(tǒng)計一次大鼠24 h 糞便粒數(shù)。收集每組大鼠的新鮮糞便，稱其濕重，置于烘箱75 ℃干燥至恒重，稱重，根據(jù)公式計算糞便含水量：

糞便含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%

1.2.3 胃腸傳輸功能的檢測 [6]在第13 周和第26周末次給藥的第2 天，每組每只大鼠依次灌服6 粒直徑1 mm 鋼珠和4 mL 的15%硫酸鋇混懸液，然后使用異氟烷麻醉大鼠，并采用X 射線成像監(jiān)測鋼珠在大鼠胃腸道內(nèi)的位置和數(shù)目[5]。根據(jù)大鼠胃排空（4 h）、小腸傳輸（9 h）和大腸傳輸（12 h）的時間，在這3 個時間點分別追蹤觀測大鼠胃腸道內(nèi)的鋼珠位置和數(shù)目變化。檢測指標如下：

胃排空指數(shù)：分別計算4、9、12 h 時間點離開胃內(nèi)的鋼珠數(shù)與灌胃的總鋼珠數(shù)目的比值。

胃腸傳輸指數(shù)：胃腸道位置評分（鋼珠位于胃內(nèi)=0；近端小腸=1；遠端小腸=2；盲腸=3；結腸=4；直腸=5；排出體外=6）與鋼珠粒數(shù)的乘積，則全部排出=36。

結腸轉運指數(shù)：計算9～12 h 內(nèi)鋼珠經(jīng)由小腸或盲腸進入結直腸或排出體外的數(shù)目。

1.2.4 生物樣本的收集和腸道組織學評分血清收集：給藥13 周和26 周后，大鼠禁食16 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，進行腹主動脈采血。血液樣品靜置2 h，3000 r·min-1離心15 min 獲得血清樣本，采用化學試劑法檢測總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、肌酐（Crea）和尿素氮（BUN）的含量變化，以及天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）的酶活力，剩余樣品置于-80 ℃保存待測。另取血液樣品測定紅細胞（RBC）、白細胞（WBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）等血液學指標。

組織取材：腹主動脈取血，立刻剖取大鼠的肝臟、腎臟、盲腸、結腸組織。用冰生理鹽水沖洗干凈，稱取肝臟和腎臟重量，置-80 ℃的冰箱保存待測。另取部分結腸、盲腸、肝臟、腎臟置于4%福爾馬林中固定，石蠟包埋切片，H&E 染色，顯微鏡觀察拍照。

腸道組織學評分：組織學評分為顏色評分與范圍評分之和。顏色：鮮紅者0 分；淺褐色1 分；暗褐色2 分；深褐色3 分。范圍：無黑變者0 分；盲腸部位1 分；近端結腸部位2 分；全結腸3 分。

結腸組織粘蛋白2（MUC2）含量測定：取近端結腸組織0.1 g，用冰PBS 緩沖液沖洗表面殘留血跡，加入一定體積的PBS 緩沖液（1∶9 的重量體積比），用組織研磨器研磨90 s，將勻漿液于4 ℃、10 000 r·min-1離心30 min，收集上清液。該液按ELISA 試劑盒說明書步驟進行檢測，于波長450 nm 處測量OD 值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以GraphPad Prime 8 軟件分析數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)用均值±標準差（）表示，樣本均數(shù)間比較用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t 檢驗。P<0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 天天膠囊對正常大鼠體重和進食量影響

如圖1-A 所示，灌胃給藥13 周和26 周后，與空白組相比，蘆薈低、高劑量組和天天膠囊低、高劑量組實驗大鼠體重無顯著性差異（P>0.05），提示天天膠囊不影響大鼠體重變化。如圖1-B 所示，各組實驗大鼠進食量也無明顯差異（P>0.05），提示天天膠囊對大鼠進食量無影響。

2.2 天天膠囊對正常大鼠排便粒數(shù)和糞便含水量影響

如圖1-C 所示，與空白組相比，給藥13 周和給藥26 周的蘆薈低、高劑量組和天天膠囊低、高劑量組的大鼠排便粒數(shù)均顯著性增加，提示蘆薈和天天膠囊均能促進大鼠排便。如圖1-D 所示，與空白組相比，給藥13 周和26 周的蘆薈低、高劑量組和天天膠囊低、高劑量組大鼠糞便含水量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示蘆薈和天天膠囊對大鼠的糞便含水量影響較小。

圖1 天天膠囊對正常大鼠體重和進食量影響（n=10）

2.3 天天膠囊對大鼠胃腸傳輸功能影響

如圖2 所示，腹部X 射線圖像顯示了各組大鼠分別在灌胃4、9、12h 后，鋼珠在胃腸道中的數(shù)目和位置。在灌胃給藥13 周和26 周后，與空白組相比，在灌胃4、7、12h 后，各給藥組的胃排空指數(shù)均沒有顯著性差異（圖3-A、圖3-B，P>0.05），說明天天膠囊不影響大鼠的胃排空能力。如圖3-C 和3-D 所示，與空白組相比，灌胃13 周和26 周后，各組的大鼠胃腸傳輸指數(shù)在4h 和9h 均無顯著性差異（P>0.05），而在12h 蘆薈高劑量組和天天膠囊高劑量組的大鼠胃腸傳輸指數(shù)顯著升高（P<0.05），說明天天膠囊高劑量可促進正常大鼠胃腸道傳輸功能。在9h 后大鼠體內(nèi)鋼珠經(jīng)過腸道蠕動進入結直腸內(nèi)。在灌胃13 周和26 周后，蘆薈高劑量組和天天膠囊高劑量組的大鼠中進入結直腸的鋼珠數(shù)目較空白組明顯增加（圖3-E、圖3-F，P<0.05），結合胃腸傳輸指數(shù)的變化，說明蘆薈高劑量和天天膠囊高劑量增強了大鼠的結腸轉運能力。

圖2 大鼠胃腸傳輸?shù)腦-射線圖像

圖3 天天膠囊對大鼠胃腸傳輸?shù)挠绊懀╪=3）

2.4 天天膠囊對大鼠血液學變化的影響

如表1 所示，給藥26 周后，與空白組相比，蘆薈低、高劑量組和天天膠囊低、高劑量組的大鼠紅細胞、血紅蛋白、血小板和白細胞數(shù)等均無明顯差異（P>0.05），炎性細胞如淋巴細胞、嗜酸性細胞、中性粒細胞數(shù)目等也無顯著性差異（P>0.05），說明天天膠囊不影響大鼠血液指標的變化。

表1 給藥26 周后天天膠囊對大鼠血液指標的影響（n=10）

2.5 天天膠囊對盲腸、結腸組織的影響

如圖4-A 所示，給藥13 周和26 周后，與空白組相比，蘆薈低、高劑量組和天天膠囊低、高劑量組的大鼠結腸組織均顏色鮮紅，無棕褐色色素沉著，同時結腸組織評分均為0，表明蘆薈低、高劑量組和天天膠囊低、高劑量組均未造成大鼠結腸黑變。

如圖4-B、圖4-C 所示，給藥13 周和26 周的蘆薈低、高劑量組和天天膠囊低、高劑量組的大鼠盲腸微絨毛正常，黏膜上皮細胞結構正常，無炎性細胞浸潤，且未見棕黃色顆粒物。與空白組相比，蘆薈兩組和天天膠囊兩組的大鼠結腸黏膜上皮細胞均結構完整，空泡狀杯狀細胞數(shù)目增加，無炎性細胞浸潤，無漿膜水腫，也未觀察到棕黃色的顆粒狀物。

圖4 大鼠結腸和盲腸的病理變化（n=3）

2.6 天天膠囊對大鼠肝腎功能影響

如表2 所示，給藥26 周后，與空白組相比，天天膠囊低劑量組的ALT 顯著性降低（P<0.01），蘆薈低劑量組TP 明顯升高（P<0.05），其他指標如AST 和ALB，各組之間均無明顯變化。與空白組相比，蘆薈低、高劑量組和天天膠囊低、高劑量組BUN 無顯著性差異，而蘆薈高劑量組的Crea 顯著升高（P<0.05），天天膠囊的兩組的Crea 無明顯變化。結果提示，給予天天膠囊的大鼠肝腎功能均正常，未見明顯病理損傷。

表2 給藥26 周后天天膠囊對大鼠肝、腎生化指標的影響（n=10）

如圖5 所示，給藥13 周后，各給藥組的大鼠肝腎指數(shù)與空白組相比，均無顯著性差異（P>0.05）。給藥26 周，天天膠囊的兩組的大鼠腎臟臟器指數(shù)未見顯著性差異（P>0.05），而蘆薈高劑量組的腎臟臟器指數(shù)顯著性升高（P<0.05）。如圖5-B 所示，在給藥13 周和26 周后，與空白組相比，各給藥組的肝臟無炎性細胞的浸潤，肝細胞無水樣變性，無脂滴樣物質，未見大小不等的空泡形成，表明天天膠囊無肝毒性。如圖5-C 所示，大鼠給藥13 周各給藥組未見腎臟病理損傷。給藥26 周的蘆薈高劑量組腎臟出現(xiàn)空泡變性，腎小球體積數(shù)目增加，而天天膠囊的兩組腎臟無明顯病理改變，未見染色深的核固縮細胞，細胞結構完整，提示天天膠囊不會造成大鼠的腎臟損傷。

圖5 大鼠肝、腎臟器指數(shù)及組織病理學分析

2.7 天天膠囊對大鼠結腸杯狀細胞、腸黏膜厚度和MUC2 表達影響

如圖6-A 所示，在大鼠給藥13 周、16 周后，與空白組相比，蘆薈高劑量和天天膠囊高劑量組的結腸杯狀細胞數(shù)目顯著增加（P<0.05 或P<0.01）。如圖6-B 所示，給藥13 周、16 周的蘆薈高劑量組和天天膠囊高劑量組腸黏膜厚度顯著增加（P<0.01、P<0.01），天天膠囊低劑量組在26 周結腸黏膜厚度增加，也有統(tǒng)計學意義。與空白組相比，給藥13 周和26 周后，天天膠囊低、高劑量組結腸腸壁厚度變化均無顯著性差異（圖6-C，P>0.05），結腸組織中MUC2 蛋白表達也無明顯差異（圖6-D，P>0.05），與圖7 的結腸組織阿爾新藍染色的結果一致，提示天天膠囊對正常大鼠MUC2 蛋白的分泌影響較小。

圖6 天天膠囊對大鼠結腸杯狀細胞數(shù)量、黏膜層厚度、粘液層厚度和粘蛋白2 表達的影響（n=10）

圖7 阿爾新藍染色結腸粘液層（×200）

3 討論

本實驗連續(xù)給予天天膠囊13 周和26 周，大鼠的腸黏膜未見棕褐色的色素顆粒沉著，未出現(xiàn)結腸黑變，未見肝腎病變損傷，天天膠囊可促進大鼠胃腸傳輸和結腸轉運。此外，天天膠囊可促進大鼠的結腸杯狀細胞數(shù)目和腸黏膜厚度的增加。

黑腸病是指褐色素的物質沉積在結腸黏膜固有層中的非炎癥性腸病。一般認為長期服用蒽醌類瀉藥是引起結腸黑變的誘因之一，臨床上報道超過70%的患者長期（平均9 個月以上）使用蘆薈等蒽醌類瀉藥會出現(xiàn)結腸黑變[7]。此外，文獻報道給予SD大鼠2 g·kg-1蘆薈全葉粉90 天，可見大鼠結腸黏膜固有層色素沉著[8]。而本研究中高劑量天天膠囊中所含蘆薈劑量為0.1 g·kg-1，遠低于文獻報道的給藥劑量，因此推測天天膠囊未出現(xiàn)大鼠結腸黑變，可能與蘆薈的給藥劑量較低有關。另有報道服用2 g·kg-1大黃30 天即可建立豚鼠結腸黑變病的模型[9]，比相同劑量蘆薈造成結腸黑變病的時間更短。這可能是由于大黃和蘆薈中所含的蒽醌類型不同引起的，化學成分研究結果表明，大黃中多為雙核蒽醌結構，蘆薈中主要是單核蒽醌。因此推測結腸黑變病的發(fā)生還可能與蒽醌的種類和結構有關。

動物實驗表明，低劑量（50 mg·kg-1）的蘆薈大黃素預處理能夠減輕CCl4引起的大鼠急性肝損傷[10]，高劑量（2 g·kg-1）的大黃素則會損害肝臟[11]。本實驗發(fā)現(xiàn)，給予蘆薈和天天膠囊13 周和26 周后大鼠肝臟均無炎性細胞浸潤的病理改變，并未造成肝損傷。因此推測可能是天天膠囊中所使用蘆薈的品種、產(chǎn)地不同，其中所含蒽醌成分的種類和含量差異影響其對肝臟的作用，但此問題有待深入研究。

臨床研究還發(fā)現(xiàn)，有人長期服用蘆薈制品誘發(fā)了急性腎功能衰竭[8]，文獻報道正常大鼠連續(xù)14 天服用0.2 mL 99.8%%蘆薈凝膠出現(xiàn)明顯的腎毒性，且腎損傷程度呈劑量依賴性[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，給藥13 周后各組大鼠腎臟BUN 和Crea 無明顯變化，而給藥26 周后蘆薈高劑量組的大鼠Crea 和腎臟臟器指數(shù)卻顯著性升高，病理結果也顯示部分大鼠出現(xiàn)腎臟損傷的病理改變。本研究進一步證明，長期大劑量服用蘆薈會對大鼠造成腎損傷，此結果與上述文獻報道一致。研究顯示，造成腎臟毒性的物質主要是蘆薈苷的氧化產(chǎn)物——蘆薈大黃素[13]。但實驗中天天膠囊低、高劑量組均未出現(xiàn)腎臟功能和病理上的變化。推測可能是天天膠囊的組方以某種方式改變了蘆薈腎毒性成分的吸收與代謝，從而降低了蘆薈的腎毒性，但該假設還有待驗證。

腸黏膜增生以杯狀細胞數(shù)目的增加導致腸黏膜增厚為主要特征，是一種非腫瘤性變化。杯狀細胞主要功能是分泌粘液蛋白，其主要成分是MUC2，粘液蛋白進入腸腔后，能夠與水等物質結合形成黏液，可以潤滑腸道，增強腸道傳輸功能，促進排便。研究發(fā)現(xiàn)，服用尿苷等藥物能夠恢復便秘大鼠減少的杯狀細胞數(shù)目、甚至增加其數(shù)目，從而改善便秘[14]。在文獻報道中，服用蘆薈苷會引發(fā)從盲腸延伸到直腸的黏膜和杯狀細胞增生[15]，本研究顯示類似的實驗結果。因此，推測促進杯狀細胞增加可能是天天膠囊改善便秘的機制之一。

有研究證實，缺乏黏蛋白MUC2 的小鼠因結腸黏液層變薄自發(fā)地發(fā)展為結腸炎[16]，且在大鼠潰瘍性結腸炎模型中，觀察到結腸病變附近分泌黏蛋白的杯狀細胞已被耗盡[17]，說明黏液層損傷與結腸炎的形成有關。腸道的黏液層主要由黏蛋白組成，能夠阻止細菌等微生物進入腸道，當黏液層增加時，可預防和治療炎癥腸病[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，天天膠囊能夠促進杯狀細胞和腸道黏液增加，因此推測天天膠囊可能會對炎性腸病有一定的治療作用。

天天膠囊長期服用可促進胃腸傳輸功能和結腸轉運，且未見明顯的毒副作用。