野生酸棗黃酮乙醇提取工藝研究

李富強，壽晨莉，張悅瑤，程文璇，王夢姣，張 玲，張東芹，王報貴

(濱州學院生物與環境工程學院&山東省黃河三角洲生態環境重點實驗室&山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心&濱州市食品安全重點實驗室，山東 濱州 256603)

1 引言

酸棗(ZiziphusjujubaMill. var.spinosa(Bunge)Hu ex H .F. Chow)，鼠李科棗屬植物，原產于長江以北的華北地區，中南地區也有分布，目前在全世界范圍內種植，分布甚廣，產量頗豐[1]。野生酸棗作為平性類植物之一，其所包含的黃酮類化合物具有安神、改善神經系統的藥用價值，是一種很強的抗氧化劑，可有效中和體內的氧自由基，從而起到延緩細胞衰老、老化；也可以改善血液循環，降低膽固醇，從而大大降低心血管疾病的病發率[2]。

黃酮類化合物在藥理、生物活性方面也有良好的活性，首先其有助于將炎性生物酶保留在體內，從而加快傷口的愈合速度，還有止痛的效果；其次因為具有強抗組織胺的特性，所以可用來治療多種敏感性疾病[3]。有研究發現蚊子草中的部分黃酮提取物對NO、IL-6炎癥因子的釋放有顯著的抑制作用，具有明顯的抗炎活性。此外，相比于不喝綠茶的人，時常喝綠茶的人患心臟病的概率小了約1/2，致命性的更是僅有前者的1/3；其中重要的原因之一就是綠茶中所含的黃酮[4]。除此之外，黃酮在降低血糖、血壓方面也具有極佳的效果，有相關結論表明，植物黃酮提取物均有不同程度降低血糖的能力，降低血清TC水平，升高SOD等水平，且其降低血糖能力與總黃酮含量有明顯的正相關關系；同時其對血液流變學的相關指標也有不同程度的改善作用[5]。黃酮類化合物具有極強的抗氧化性，主要表現在它基于獨特的化學結構能夠減少自由基的生成同時具有中和自由基的能力，且黃酮中羥基的數量越多，其質子所具有的能力就更強，也就會提高其對氧化效果的對抗作用。研究表明：在新鮮果蔬中，如部分蔬菜類的黃酮提取物對Fe3+有不低的中和作用以及極高的中和DPPH等類似自由基的活性，且其中和強度在活性物質提高的情況下也會有相應的提高[6]。也有其他結論表明，黑果枸杞當中的黃銅提取物其在抗氧化能力方面已經明顯優于抗壞血酸[7]。

目前發現，酸棗當中具有黃酮類物質，但未被充分利用，部分提取工藝尚不夠完善[8，9]。因此本課題研究采用超聲輔助乙醇提取工藝提取野生酸棗中黃酮的最佳提取工藝。總體目的是在單因素實驗和正交試驗的模型下，找出最優的提取工藝參數如時間、溫度、料液比等，以期由此獲得最好的提取方式，將會對酸棗中黃酮的利用最大化，為酸棗的綜合利用提供一種切實可行的工藝，對未來對酸棗的開發和產業利用提供參考價值。

2 實驗材料和方法

2.1 主要儀器與試劑

紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技中國有限公司)，紅外干燥箱(上海景邁儀器設備有限公司)，海信(山東)冰箱， KQ-A1000DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，電子天平(上海菁海儀器有限公司)，JJ-2 組織搗碎機，酸棗(山西中晉元農貿有限公司)，無水乙醇(煙臺遠東精細化工有限公司)，Rutin-蘆丁標品(合肥博美生物科技有限責任公司)，硝酸鋁(天津市福晨化學試劑廠)，亞硝酸鈉(天津市福晨化學試劑廠)，氫氧化鈉(天津市福晨化學試劑廠)。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品預處理

把清洗過的食品級酸棗去核處理，將果核上的果肉分離干凈，用剪刀將果肉及果皮部分剪成小塊狀，平鋪在清洗并烘干的托盤上，保持在45 ℃下，于紅外干燥箱中烘干至重量不變，取出后進行粉碎處理，然后過40目篩，裝入密封袋中，保存于4 ℃冰箱中備用[10]。

2.2.2 蘆丁標準曲線的繪制

首先配制0.2 mg/mL的標準母液，并以其作為對照。步驟為：準確稱量蘆丁標準品(20.00 mg)，于恒溫(40 ℃)水浴下使用乙醇進行溶解，而后在室溫下定容于50 mL的燒杯中、震蕩搖勻后備用。將蘆丁標準母液用5 mL的移液管分別吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL至預先準備好的25 mL具塞試管中，同時做一組空白對照，首先加入配制好的濃度為5%的亞硝酸鈉溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min，接著加入濃度為10%的硝酸鋁溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min，再加入濃度為4%的氫氧化鈉溶液7.5 mL，最后用相同濃度的乙醇濃度定容至25 mL，搖勻靜置15 min[9]。以0 mL母液的對照組為參照，用紫外分光光度計的510nm處，測定各樣品的OD值，每樣平行測定3次取平均值，用每組樣品計算出的蘆丁標準母液濃度(x)為橫軸，OD值(y)為縱軸繪制蘆丁標曲。

2.2.3 黃銅的提取

準確稱取1.0 g樣品酸棗粉，放置于50 mL離心管中，加入相對應濃度和體積的浸取液乙醇，搖勻，使酸棗粉和乙醇溶液充分混勻，在適當的超聲功率下提取一定時間的黃酮。將提取液置于高速冷凍離心機中，在4200 r/min條件下離心20 min后，取上清液并添加相應濃度提取液至體積相同，靜置備用。

2.2.4 黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al(NO3)-NaOH光度法檢測總黃酮含量[8]。用1000 L移液槍吸取1mL備用樣液于離心管中，再依次用相同規格移液槍精確添加NaNO2溶液、Al(NO3)溶液和NaOH溶液各0.4 mL，注意每次添加后均需進行震蕩加靜置步驟，時長分別為6 min、6 min和15 min，而后測定其OD510nm值，依照前一步繪制的蘆丁曲線和公式(1)得出黃酮總量：

(1)

式(1)中：c為由蘆丁標曲對應算出定容后待測樣液中總黃酮的質量分數，mg/mL；n為稀釋倍數；v為樣液的總體積，mL；m為野生酸棗粉質量，mg。

2.3.5 單因素試驗

單因素試驗水平見表1。

表1 單因素試驗水平

2.2.6 數據處理

各單因素及標曲實驗數據均在Word整理，查閱相關文獻確定各因素實驗初步范圍，確定單因素水平表，收集標曲和各單因素平行實驗數據，在Prism中繪制折線圖；參照單因素結果確定正交試驗因素水平表，在SPSSAU網頁中制作正交表；記錄正交試驗數據進行整理分析得出總黃酮得率最高的組合。

3 結果與討論

3.1 蘆丁標準曲線的繪制

由圖1可以得出，蘆丁標曲回歸方程為：y=12.889x-0.0003，R2=0.9991，線性關系較好。

圖1 蘆丁標準曲線

3.2 單因素實驗結果

3.2.1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響結果

從圖2可以發現，在提取劑濃度較低時，乙醇體積分數與總黃酮提取率成正相關，即隨著體積分數逐漸增大，總黃酮提取率也逐漸升高，并在濃度為55%時達到峰值，但是，隨著乙醇體積分數的繼續增大，總黃酮提取率開始降低。出現這種曲線出現可能是55%乙醇的極性與酸棗粉中提取物的極性相差較小，所以，這種溶質與溶劑結構上的相似，導致提取物與提取液彼此互溶達到最大，也就表現為黃酮得率最高。因此乙醇濃度為55%是最適的提取濃度，并用于后續單因素試驗。

圖2 乙醇濃度對得率的影響

3.2.2 液固比對總黃酮得率的影響結果

由圖3可知，當液固比處于5∶1至25∶1之間時，液體含量與黃酮得率成正比，即液體含量越多，黃銅得率就越大，并且液固比為25∶1所得率達到峰值(1.243%)，而當液固比升高到30∶1(mL/g)時出現下降趨勢。由此可說明當浸取的體積液過低時，無法將樣品當中的黃酮全部浸取出來，不能徹底溶出黃酮，因此隨著浸取液的增多，浸取液更完全的浸取黃酮，當浸取液足夠多時，酸棗粉當中絕大部分的黃酮能夠被浸取，黃酮得率達到最高，當浸取液的用量繼續增加時，可能會浸取出部分會影響黃酮顯色反應及吸光度測定的雜質，或者會使部分黃酮發生變性，并且加入過量的浸取液會造成試劑的浪費，綜上考慮，最佳液固比為25∶1(mL/g)，并用于后續單因素試驗。

圖3 液固比對得率的影響

3.2.3 超聲時間對總黃酮得率的影響

由圖4可知，超聲時間處于20～40 min時，總黃酮得率與時長成正比，即時間越長，得率越大，直至40 min時到達峰值；隨后，超聲時間的延長致使總黃酮得率出現較大幅度降低。這種現象的原因可能是當時間短于20 min時，酸棗中黃酮浸取未達到飽和，得率較低；隨著時間增加，黃酮化合物有充足的時間析出，得率隨之上升。但當時間超過40 min之后，浸取液在較高溫度下部分揮發，導致損失使得率下降；同時，較長時間處于較高溫度下，黃酮類物質也容易被分解破壞，或者發揮抗氧化性而被分解，引入其它雜質，使得率下降。因此，全面考慮確定最佳超聲時間為40 min，并用于后續單因素試驗。

圖4 超聲時間對得率的影響

3.2.4 超聲溫度對總黃酮得率的影響

由圖5可以看出，在40 ℃之前，隨著超聲溫度的逐漸升高，總黃酮得率急劇升高，并在40 ℃時總黃酮的得率達到峰值，隨后其隨著超聲溫度的增加呈逐漸下降趨勢。造成這種趨勢的原因可能為，在40 ℃之前，溫度對黃酮化合物的溶出起主導影響，隨著超聲溫度的升高，分子熱運動速度加快，混合溶液的粘性降低，使得浸取效率較高，當溫度升高到30～50 ℃時，總黃酮的得率較為穩定，表明酸棗當中黃酮在這段溫度區間較為穩定，浸取率較高且沒有被大量破壞；當隨著溫度繼續升高至50 ℃之后，表明溫度對黃酮的黃酮類化合物的破壞作用已經較為嚴重，此時析出雜質的量也較高，使得率出現較大幅度的下降趨勢。此外，綜合考慮溫度過高耗能和對浸取液揮發這一重要影響因素，確定最佳的超聲溫度為40 ℃，并用于后續單因素試驗。

3.2.5 超聲功率對總黃酮得率的影響

由圖6可以看出，400～500 W總黃酮得率隨著超聲功率的升高出現緩慢的上升趨勢，并在500 W超聲功率達峰值，隨后其隨著超聲功率的升高得率出現緩慢降低的趨勢。出現這種趨勢是因為，利用超聲波輻射壓強產生的強烈空化效應、機械振動、擾動效應、擴散、擊碎和攪拌作用等多級效應，增大物質分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速黃酮類化合物進入乙醇溶液，以此提高總黃酮得率。但隨著超聲功率的升高，總黃酮得率下降可能使其他雜質物質析出，影響黃酮化合物的溶出，確定最佳功率為500 W。

圖5 超聲溫度對得率的影響

圖6 超聲功率對得率的影響

3.3 正交試驗結果

參照3.2單因素試驗所得出的試驗數據及分析情況，選取對酸棗果肉及果皮黃酮得率影響作用更顯著的因素(即乙醇濃度、液固比、超聲溫度和時間)，繼續進行了正交試驗，以優化超聲波輔助浸取酸棗果皮和果肉中總黃酮的工藝參數，因超聲功率影響較小，故綜合耗能考慮選擇超聲功率400 W，正交試驗結果見表2。

實驗結果表明：在試驗5中酸棗粉黃酮的得率達到最大值，最優組合為A2B2C3D1，此時酸棗果肉及果皮中黃酮得率可達1.447%。通過比較R值可以發現，各因素的影響程度順序為A-乙醇濃度最顯著，C-液固比較明顯，D-超聲溫度次次，D-超聲時間最弱，據此得到最佳提取因素是：乙醇濃度55%；超聲時間40 min；液固比27∶1 (mL/g)；超聲時間35 ℃；超聲功率400 W。

4 結論

本研究先進行單因素實驗，來探究乙醇濃度、液固比及超聲溫度、時間和功率對黃酮提取率的影響，結果表明超聲功率的影響最小，綜合考慮耗能因素選取400 W為最佳功率。而后，進一步通過正交試驗分析另4種因素，得以確定酸棗果肉及果皮中黃酮的最優提取條件為：乙醇濃度55%；超聲時間40 min；液固比 (mL/g) 27∶1；超聲時間35 ℃；超聲功率400 W。此時的酸棗果肉及果皮黃酮的浸取率為1.477%，相比于其他條件屬最高且綜合能耗較低，既滿足使用要求，也符合經濟效益；整體試驗結果還表明酸棗果肉及果皮中有較多黃酮含量，具有很好的利用價值，本研究工藝很大程度上能促進酸棗資源的綜合開發和產業開發。