UPLC-MS/MS分析牛肉紅朱橘成熟果實多酚類化合物積累特征

李文云，韓秀梅，柏自琴，羅 懌，王小柯，林 乾，李金強，馬玉華

（貴州省農業科學院果樹科學研究所，貴州貴陽 550006）

柑橘主栽類型主要包括寬皮柑橘、柚類、橙類、檸檬等，不僅果形優美、酸甜爽口、香味濃郁，還富含多種生物活性成分，其中多酚類化合物是柑橘最常見的一類生物活性成分[1]。多酚類化合物廣泛存在于根、莖、葉、花、果實和種子中，泛指化學結構中具有苯環和多個酚基團的一類次生代謝產物的總稱，主要包括類黃酮、木質素、香豆素、酚酸、苯醌等[2-4]。多酚類化合物不僅與園藝產品外觀、產量、營養品質、抗性和適應性等密切相關，在人體健康方面也發揮著重要作用，被稱為人體“第七類營養素”，但人體自身不能合成，需從食物中攝取。多酚類化合物通常以抗氧化劑的形式清除人體活性氧自由基、抑制細胞過氧化、保護細胞免受損傷[5]，在調解免疫活性、改善心血管功能、抗炎鎮痛、抗癌等方面發揮多重藥理活性，被廣泛應用于功能食品、保健品、貯藏保鮮等領域[6]。隨著社會進步和生活水平的提高，以及對大健康理念的認知加深，消費者更加注重對果實品質和功能性成分追求。因此，柑橘多酚類化合物因極具研究和應用價值而被廣泛關注。

牛肉紅朱橘是朱紅橘的自然突變體，其果實呈橘紅色，香味濃郁持久，是貴州地方特色柑橘品種[7-8]。本文以兩個地方特色柑橘種質-朱紅橘和紅香柚為對照，利用UPLC-MS/MS比較分析多酚類化合物積累特征并篩選差異代謝物，探索牛肉紅朱橘成熟果實多酚類化合物積累特征，以期為牛肉紅朱橘生產栽培、營養評價和功能性成分挖掘利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肉紅朱橘（NRH）、朱紅橘（ZHJ）、紅香柚（HXY） 15年生，均采自貴州省惠水縣爛壩林場，砧木為枳殼，栽培管理條件一致。選擇長勢良好、無病蟲的植株3株，在樹冠外圍不同方位隨機采摘健康、無病蟲的成熟果實，帶回實驗室，用蒸餾水將果面清洗干凈，將果實隨機分成3組，設置3次生物學重復，分離果肉迅速用液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測；甲醇、乙酸、乙腈等 色譜純，均購自國藥集團。

CBM30A超高效液相質譜 配有電噴霧離子源（ESI）和Analyst 1.6.3數據處理軟件，日本島津公司；QTRAP 6500串聯質譜 美國ABI公司； HSS T3 C18色譜柱（1.8 μm, 2.1 mm×100 mm） 美國Waters。

1.2 實驗方法

1.2.1 代謝物提取 將真空冷凍干燥后的樣品研磨成細碎的粉末，準確稱取100 mg，并加入1.2 mL 70%甲醇溶液。震蕩渦旋混勻，隨后置于4 ℃冰箱過夜浸提，10000×g離心10 min，用注射器吸取上清。過0.22 μm的微孔濾膜于上樣瓶中待測。

1.2.2 代謝物檢測 參照Chen等[9]的方法，詳細檢測方法如下：

液相條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（1.8 μm, 2.1 mm×100 mm）。流動相A相為超純水（含0.04%乙酸），B相為乙腈（含0.04%乙酸）。洗脫梯度為：0 min B相為5%，10 min內B相增加至95%，保持95% 1 min，11.00～11.10 min，B相降為5%并平衡至14 min。柱溫設置為40 ℃，進樣量2 μL。

質譜條件：電噴霧離子源溫度550 ℃，質譜電壓5500 V，簾氣30 psi，碰撞誘導電離參數設置為高。

1.3 數據處理

利用二級譜信息對物質進行定性，利用質譜峰對物質進行峰面積積分[10]。利用R軟件制作聚類熱圖用于分析代謝物相對豐度?；贠PLS-DA（Partial Least Squares Discrimination Analysis，偏最小二乘判別分析）模型，根據差異倍數值和VIP值（Variable Importance In Project，變量重要性投影）來篩選差異代謝物。滿足VIP值≥1且Fold Change≥2或Fold Change≤0.05的物質即為差異代謝物。

2 結果與分析

2.1 三個地方種質多酚類化合物積累特征分析

聚類熱圖分析結果表明，NRH、ZHJ和HXY明顯區分開，說明三者代謝物存在明顯差異，且同一種質三個生物學重復聚在一起，表明數據可靠（圖1）。本研究共鑒定出493種物質（其中多酚類化合物約占60%），依次為類黃酮（Flavonoids）163種，酚酸（Phenolic acids）71種，氨基酸及其衍生物（Amino acids and derivatives）55種，木脂素和香豆素（Lignans and Coumarins）35種，脂質（Lipids）29種，核苷酸及其衍生物（Nucleotides and derivatives）27種，有機酸（Organic acids）27種，生物堿（Alkaloids）24種，萜類（Terpenoids）5種，醌類（Quinones）1種，鞣質（Tannins）1種，其它（Others）55種。

圖1 聚類熱圖分析代謝物相對豐度Fig.1 Metabolites relative abundance analysis by heat map

從熱圖分析結果上我們還可以看出，NRH與ZHJ聚類在一起，相距更近，兩者代謝物種類基本一致，差異主要在含量上；而與HXY代謝物種類和含量差異較大，在熱圖上距離相對較遠。NRH檢測到的物質數量最多（460種），ZHJ次之（457種），HXY最少（409種）。其中毛蕊異黃酮、木犀草素、2'-羥基金雀異黃素、表兒茶素、阿魏酸-4-羥基香豆素、4-羥基-7-氧甲基香豆素鼠李糖苷、7,8-二羥基-5,6,4'-三甲氧基黃酮、澤蘭黃素、芹菜素-8-C-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、金雀異黃素-8-C-葡萄糖苷、橙皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷-7-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-新橙皮苷-7-葡萄糖苷等多酚類化合物僅在NRH和ZHJ中檢測到。而瑞香素、異莨菪亭、香柑醇、佛手柑內酯、花椒素、異歐前胡素、對香豆?；?、飛燕草素、異鼠李素-己糖丙二酸等多酚類化合物僅在HXY中檢測到。

2.2 差異物質的鑒別與篩選

火山圖分析結果表明（圖2），NRH和HXY比較組篩選到287種差異代謝物，其中179種下調，108種上調。ZHJ和HXY比較組篩選到292種差異代謝物，其中194種下調，98種上調。ZHJ和NRH比較組僅篩選到54種差異代謝物，其中42種下調，12種上調。

圖2 不同比較組差異代謝物火山圖Fig.2 Volcano plot of differential metabolites in different comparison groups

韋恩圖結果表明（圖3），三個比較組共有的差異代謝物有29種（其中多酚類化合物占83%），具體物質信息見表1，其中類黃酮13種，香豆素6種，核苷酸及其衍生物2種，酚酸類2種，其它2種，氨基酸及其衍生物、木脂素、生物堿和醌類各1種。

表1 三個比較組共有差異代謝物Table 1 Common differential metabolites among three comparison groups

圖3 韋恩圖（Venn）展示三個比較組共有和特有差異代謝物Fig.3 Common and unique metabolites among three comparison groups explained by Venn

ZHJ和HXY比較組分別篩選到19種差異代謝物（其中多酚類化合物占42%）（圖3，表2），其中類黃酮、核苷酸及其衍生物、酚酸類、脂質和其它類均為3種，生物堿2種，有機酸和氨基酸及其衍生物各1種。NRH和HXY比較組篩選到14種特異代謝物（其中多酚類化合物占57%），其中酚酸類5種，有機酸、類黃酮和脂質均為2種，核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、木脂素各1種。ZHJ和NRH比較組篩選到11種差異代謝物（其中多酚類化合物占91%），其中類黃酮5種，酚酸類4種，有機酸1種，木脂素和香豆素1種。

表2 各比較組篩選到的特異代謝物Table 2 Specific metabolites selected in each comparison group

2.3 差異代謝物功能注釋和富集分析

差異代謝物KEGG富集分析表明，NRH vs HXY比較組差異代謝物參與了苯丙烷合成、異黃酮合成、黃烷酮和黃酮醇合成等20個生物過程（圖4A）。ZHJ vs HXY比較組差異代謝物參與了氨基酸合成與降解、氧化磷酸化、丙酸代謝、苯丙烷合成、黃烷酮和黃酮醇合成等20個生物過程（圖4B）。ZHJ vs NRH比較組差異代謝物參與了黃烷酮和黃酮醇合成、牛磺酸代謝、核黃素代謝、苯丙烷合成、嘧啶合成、嘌呤合成等11個生物合成過程（圖4C）。

圖4 差異代謝物KEGG富集分析Fig.4 Differential metabolites enrichment analysis by KEGG

3 討論

多酚類化合物是廣泛存在于植物體的一類重要的天然抗氧化物質，對人體健康發揮著重要作用[11-12]，目前已經鑒定分離出8000余種[13]。多酚類化合物屬于苯丙烷的衍生物，糖酵解途徑和戊酸磷酸途徑生成的中間產物經莽草酸途徑形成前體物質苯丙氨酸，隨后通過苯丙烷代謝途徑進一步形成類黃酮、木質素、香豆素、酚酸、生物堿、鞣質等[14-15]。其中類黃酮是多酚類化合物最大一個亞類，也是柑橘研究最廣泛深入的一類生物活性成分，根據苯環位置和羥基個數分為黃烷酮、黃酮、黃酮醇和花青苷等，游離態的苷元較少，大部分經糖基化、異戊烯基化和甲基化等修飾作用以衍生物的的形式存在，如橙皮苷、柚皮苷、柚皮蕓香苷、新橙皮苷等[16-18]。隨著消費者對優質、健康果品需求不斷升級，該類物質積累特征、開發和創新利用一直是育種者關注的熱點。

多酚類化合物受品種、生長發育階段、組織部位、生態條件等內在和外在多種因素影響下，共同形成獨特的積累特征[19-20]。其中，品種是影響多酚類化合物組成和含量決定性因素之一，如咖啡酸、食子酸、原兒茶酸、肉桂酸阿魏酸和鞣花酸等酚酸在不同棗品種間存在顯著差異[21]。作為蘋果主要抗氧化成分的多酚類物質在各個品種間差異顯著[22]。鄭潔等[23]分析椪柑、砂糖橘、紐荷爾臍橙、雞尾葡萄柚、檸檬、金柑等品種果實中酚酸和類黃酮組分時發現，椪柑和雞尾葡萄柚果皮總酚含量最高，金柑最低；類黃酮在雞尾葡萄柚果皮中含量最高，其次是椪柑和紐荷爾臍橙。本研究結果表明三個地方特色柑橘種質果實中多酚類化合物種類和相對含量呈現出種質特異，遺傳背景相似的種質，其代謝物種類和相對含量也更為接近。具體表現為同為寬皮柑橘的NRH和ZHJ，代謝物種類和相對含量更為接近，兩者篩選到的差異代謝物較少；兩者與柚類HXY代謝物種類和相對含量差異明顯。進一步說明代謝物種類與種質類型間存在密切聯系。

類黃酮是柑橘果實中含量豐富的一類多酚類化合物，不僅影響果實著色和風味，對果實營養價值也具有重要影響，是果實品質的重要組成部分[4]。根據化學結構類黃酮可分為查爾酮、黃酮、黃酮醇、異黃酮、黃烷醇和花青素等，大部分類黃酮苷元（如柚皮素、橙皮素、香葉木素、山奈酚等）形成后，進一步經過糖基化、?；图谆刃揎椥纬煞€定的產物，柑橘中類黃酮主要修飾方式為糖基化[24]，如檢測到的蕓香柚皮苷、柚皮苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷等。除檢測到大量的類黃酮糖基化產物外，同樣檢測到在柑橘中特異積累的多甲氧基黃酮（含2個或2個以上甲氧基），如5,6-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮、5,2'-二羥基-7,8-二甲氧基黃酮、單羥基三甲氧基黃酮、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黃酮和5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮等，這類物質在抗炎、抗氧化和抗腫瘤等方面具有廣泛的藥理作用[25-26]。

除類黃酮外，酚酸類也是本研究中檢測到較豐富的一類化合物，其泛指同一苯環上有若干個羥基的一類化合物的總稱。柑橘中主要以酰胺、酯或糖苷結合態存在，游離態的較少[27]。如本研究中檢測到的香豆酸、芥子酸甲酯、原兒茶酸-4-葡萄糖苷、丁香酸-O-葡萄糖苷、2,5-二羥基苯甲酸-O-己糖苷和1-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖等。

柑橘多酚類化合物種類豐富，從頭合成途徑較長，涉及上下游的多條代謝途徑，如上游的糖酵解、磷酸烯醇式丙酮酸和戊酸磷酸途徑等，下游的莽草酸、苯丙烷、甲羥戊酸等多條生物代謝途徑[28-29]。以及苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）[30]、4-香豆酰-CoA-連接酶（4-coumarate coenzyme A ligase, 4CL）[31]、查耳酮合成酶（Chalcone synthase, CHS）[32]和肉桂酸-4-羥基化酶（Cinnamate 4-hydroxylase, C4H）[33]等多個限速酶的作用。各品種間生物活性成分種類和含量的差異，具體是哪些代謝物、代謝途徑、關鍵結構基因或調解基因起主導作用，還有待從結構基因、轉錄調控、環境調控、庫源供應等多個層面深入研究。