驢骨膠原蛋白肽對骨質疏松大鼠的改善作用

周廣運，樊雨梅，劉楚怡，廖 峰，張筱梒，李八方,

（1.國家膠類中藥工程技術研究中心/東阿阿膠股份有限公司，山東聊城 252200；2.青島海洋生物醫藥研究院，山東青島 266001）

驢骨是驢屠宰后的副產物，約占驢總重量的10%。目前，大多數的驢骨被廢棄，只有少部分被加工成骨粉或骨泥等附加值較低的產品[1]。分析驢骨的化學組成可知，驢骨中蛋白質的含量可達25%[2]，且主要組成蛋白為膠原蛋白。膠原蛋白作為一類結構特殊的蛋白，在美容、醫藥及食品中都有著廣泛的應用[3-5]，但同時作為大分子蛋白，膠原蛋白只有在人體內逐步分解為氨基酸才能被吸收利用。而肽作為蛋白質的中間水解產物之一，與蛋白質相比較，能被人體更好地消化吸收利用，同時，相關研究也表明小分子肽還具有多種調節人體生理功能的作用[6-8]。

骨質疏松是中老年人常見的一種病癥，主要表現為骨質量下降、骨脆性增加、易骨折等[9]。目前用于改善和治療骨質疏松的方法包括藥物干預及營養補充劑等，但由于藥物治療存在著一定的副作用，越來越多的患者將營養補充劑作為首選。在營養補充劑的使用報道中，除含鈣類物質使用較普遍外，膠原蛋白肽類抗骨質疏松的研究報道也備受關注[10-12]。

驢骨膠原蛋白肽（donkey bone collagen peptide，DBCP）是驢骨膠原蛋白水解后的產物，由于驢資源的稀缺和珍貴，關于DBCP的功效研究報道很少，其中劉楚怡等[13]開發了一種不同分子量抗骨質疏松驢骨肽的制備工藝，但具體的生理作用效果并未作研究。相關研究也表明不同分子量的膠原蛋白肽在理化、功能及吸收方面都存在著較大的差異[14-16]。對此，本研究以劉楚怡等[13]的驢骨活性肽制備工藝為基礎，對相關制備方法進行了優化，重點研究了不同分子量DBCP對改善骨質疏松的功效作用，以期為DBCP的功效證實、擴展及產品開發轉化提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

驢骨膠原蛋白 東阿阿膠股份有限公司；SD大鼠 SPF級（動物許可證號SCXK（魯）20140007），濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；血清鈣檢測試劑盒、血磷檢測試劑盒、TNF-αELISA檢測試劑盒、堿性磷酸酶檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、氯化鈉 分析純，北京化學試劑公司；胰蛋白酶 食品級，南京龐博公司；青霉素、乙醚、PBS緩沖液 生物級，美國Gibico公司。

AY220電子分析天平 日本島津公司；VORTEX 1圓周振蕩搖床 廣州儀科實驗室技術有限公司；TS-1渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；GL-20B高速冷凍離心機 上海安亭實驗儀器廠；pHS-3C精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；SY21-NI4V恒溫水浴鍋 北京長風儀器儀表公司；UV-2010PC紫外分光光度計 上海尤尼克儀器有限公司；SM-2.8-10型馬弗爐 天津市華北實驗電爐廠；BH-2顯微鏡 Olympus公司；680型全自動酶標儀 美國BIORAD公司；GK99-UNIGAMMA XRAY PLUS雙能X射線骨密度儀 北京中西遠大科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同分子量DBCP的制備 參考劉楚怡等[13]不同分子量DBCP的制備方法。以驢骨膠原蛋白為原料，采用胰蛋白酶進行酶解，使用氫氧化鈉溶液調節體系pH，具體制備工藝條件見表1。酶解結束后，95 ℃條件下滅酶活，得到的酶解產物過濾去雜，并進行0.8 μm抽濾膜超濾，最后將溶液通過旋轉蒸發儀濃縮，倒入玻璃平板凍干。

表1 不同分子量驢骨膠原蛋白肽的制備工藝條件Table 1 Preparation conditions of donkey bone collagen peptides with different molecular weights

1.2.2 大鼠骨質疏松模型的構建 本研究參考較常用的去卵巢手術法構建大鼠的體內骨質疏松模型[12]。選取健康的SPF級雌性SD大鼠，體重200±20 g，全部動物適應性喂養14 d后，將動物隨機分為假手術組和去卵巢手術組。大鼠去卵巢操作：首先將大鼠麻醉仰臥固定，于腹中線兩側處去毛，并使用75%酒精消毒，待稍干后做縱形切口，切開皮膚和腹肌；之后打開腹腔，撥開脂肪層找到子宮角，沿子宮角方向向上將其盡頭處的組織輕輕拉出，分離脂肪，即可找到被脂肪包裹的卵巢組織；用止血鉗夾在卵巢與子宮角末端位置，使用手術線結扎后，將卵巢組織及其連帶的脂肪全部切除，然后將剩余子宮角送回腹腔；最后將腹肌和皮膚分層進行縫合后，傷口處灑適量青霉素鈉溶液進行消毒。同法剪除另一側卵巢。假手術組大鼠僅打開腹腔后摘除少量脂肪組織。

1.2.3 動物分組及配方飼喂 手術后4周，將接受去卵巢手術的大鼠隨機分為7組，其中1～6組為受試樣品組，第7組為陰性對照組，假手術大鼠設為第8組，總計8組，每組10只。大鼠飼料的配制參照AIN-93標準配方（見表2），其中3種不同分子量的DBCP各設2個劑量組，DBCP分別占比2%和4%。1～6組按照A～F飼料配方喂養，陰性對照組和假手術組按照G配方喂養，實驗期間動物自由飲用蒸餾水。大鼠按各配方飼喂12周，期間觀察大鼠活動、飲食等一般狀況，每周稱量體重一次。

表2 不同分子量驢骨膠原蛋白肽飼料配方Table 2 Formula of donkey bone collagen peptide with different molecular weights

1.2.4 大鼠子宮指數及形態觀察 喂養結束后，大鼠放血處死，取出子宮器官，仔細清除周圍結締組織并立即稱重，計算子宮指數。之后，將子宮置于中性甲醛溶液中固定，流水沖洗，對子宮樣本進行常規石蠟包埋并切片染色。染色采用蘇木精-伊紅染色法，染色流程為：切片復水后，蘇木素染液染色5 min，用1%的鹽酸-乙醇分色，水洗15 min左右；伊紅染液染60 s，95%的酒精和100%的酒精各分色3 min，二甲苯中脫水完全，中性樹膠封片。最后使用光學顯微鏡對各組大鼠子宮形態變化進行觀察。

1.2.5 血清樣本的處理及生化指標的測定 大鼠飼喂12周，末次喂養后，各組禁食不禁水12 h。將大鼠用乙醚麻醉后進行腹主動脈取血，血液于室溫靜置30 min后，于4 ℃、4000 r/min條件下離心15 min，分離得到的血清-80 ℃貯存。血清樣本解凍后渦旋振蕩混勻，按照各試劑盒說明書檢測血清樣本中各基本指標含量，包括血鈣、血磷、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐、尿素氮、堿性磷酸酶、腫瘤壞死因子和雌二醇等。

1.2.6 大鼠股骨與脛骨分離處理 沿大鼠關節走向，小心將雙側股骨與脛骨取下，并用剪刀及紗布剔凈附著于骨上的肌肉與結締組織。使用生理鹽水浸泡過的紗布將右側股骨樣本包裹，使其保持濕潤，置于-80 ℃冰箱保存，用于骨密度檢測；左側股骨樣本置于-80 ℃冰箱保存，備用。右側脛骨樣本置于中性甲醛溶液中固定備用，用于制作骨切片；左側脛骨樣本快速清理后保存于-80 ℃冰箱中，備用。

1.2.7 大鼠股骨骨密度測定 將大鼠股骨樣本取出，去除包裹樣本所用的紗布，將保持濕潤的股骨樣本放于測試臺水膜之上，使用雙能X射線骨密度儀對樣品進行掃描，掃描時切換至小動物模式。掃描結束后使用配套軟件對股骨樣本的骨密度進行分析。

1.3 數據處理

采用SPSS21.0對數據進行顯著性分析，組間比較采用單因素方差分析，顯著性水平為P＜0.05或P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 DBCP對骨質疏松大鼠的安全性評價

2.1.1 DBCP對大鼠體重的影響 體重能夠在一定程度上反映出生物體的健康狀況，樣品飼喂期間各組大鼠的體重變化如圖1所示。

由圖1可知，隨著整個實驗過程的進行，各組大鼠的體重均呈現逐漸上升的趨勢。不同組間比較，去卵巢的陰性對照組大鼠體重增加速度明顯高于假手

圖1 各組大鼠體重隨喂養時間的變化情況Fig.1 Changes of body weight of rats in each group with feeding time

術組，這主要為大鼠去卵巢后，自主活動減少致體重增加，即去卵巢手術對大鼠體重的增加有一定的激發作用，這與相關文獻報道相一致[17]。自第8周起，所有實施去卵巢手術組的大鼠體重與假手術組相比，均呈現出顯著性差異（P＜0.05）。進行至第12周時，六組DBCP組與去卵巢陰性對照組相比，均不存在顯著性差異，這表明DBCP不會引起去卵巢大鼠體重的顯著變化，即DBCP不能逆轉摘除卵巢對大鼠體重產生的代償性肥胖。

2.1.2 DBCP對大鼠子宮的影響 大鼠去卵巢后，由于雌激素水平的降低，會使子宮發生萎縮等現象。喂養結束后，在對大鼠的解剖過程中，可明顯看出假手術組大鼠子宮形態飽滿，子宮角粗大且顏色紅潤健康；而摘除卵巢的大鼠子宮萎縮、子宮角變細，色澤泛白，可比較直觀地判斷出去卵巢大鼠骨質疏松模型造模成功。數據比對方面，子宮指數作為評價子宮變化的衡量標準之一，DBCP對大鼠子宮指數的影響結果如圖2所示。與假手術組相比，去卵巢后的大鼠子宮指數均呈現極顯著性降低（P＜0.01），說明去卵巢手術成功，大鼠骨質疏松模型造模成功，可用于受試物評價。而與陰性對照組相比，樣品組大鼠子宮指數雖有一定程度的下降，但差異不顯著（P＞0.05），說明受試樣品均不能改善去卵巢所致的子宮萎縮現象，同時也說明各樣品均不會對大鼠體內雌激素的分泌產生影響，長期食用不會引起副作用。

圖2 DBCP對大鼠子宮指數的影響Fig.2 Effect of DBCP on uterine index in rats

為了更好地觀察大鼠子宮的變化，分別對各組大鼠子宮進行了切片染色，觀察結果如圖3所示。可以看出：假手術組子宮壁細胞形態飽滿，且子宮內膜較厚，去卵巢組的子宮內膜壁顯著變薄，且發生了明顯的萎縮。而六組DBCP均未對去卵巢大鼠的子宮形態產生顯著性影響，切片結果均與陰性對照組類似。因此，可判定各樣品組均不能改善由去卵巢所致的子宮萎縮現象，對子宮的形態及質量亦均無顯著性作用。此研究結果與DBCP對大鼠子宮指數的影響相一致。

2.1.3 DBCP對大鼠肝功能的影響 谷丙轉氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）和 谷 草 轉 氨 酶（Aspartate aminotransferase，AST）是評價肝功能受損的重要指標，可指示急性肝細胞的損傷。圖4展示了DBCP對大鼠ALT和AST活力的影響。由圖可知，各組間ALT、AST酶活力均未見顯著性差異（P＞0.05），可判定DBCP不會引起大鼠肝功能的損傷。

圖4 DBCP對大鼠ALT和AST酶活力的影響Fig.4 Effect of DBCP on ALT and AST activities in rats

2.1.4 DBCP對大鼠腎功能的影響 血清尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）由腎小球濾過排出，正常BUN參考值為：2.9～7.5 mmol/L，腎功能不全時，BUN將升高。圖5顯示了DBCP對大鼠BUN含量的影響，與假手術組相比，陰性對照組大鼠BUN含量呈現極顯著性升高（P＜0.01），但仍在正常值范圍內；而各組DBCP與陰性對照組相比，除1～3 kDa 2% DBCP和＞3 kDa 4% DBCP外，BUN含量均呈現極顯著性下降（P＜0.01），說明DBCP對骨質疏松大鼠腎小球濾過功能有一定的促進作用。

圖5 DBCP對大鼠BUN含量的影響Fig.5 Effect of DBCP on BUN content in rats

肌酐（Creatinine，Cr）通常也作為評價腎臟的功能性指標，DBCP對Cr含量的影響如圖6所示。由圖6可知，與假手術組相比，各組大鼠的Cr含量均未見顯著性差異（P＞0.05）。說明去卵巢手術和各組DBCP喂養均不會對大鼠Cr含量帶來顯著性影響。

圖6 DBCP對大鼠Cr含量的影響Fig.6 Effect of DBCP on Cr content in rats

綜上所述，受試樣品DBCP各劑量組均不會顯著影響大鼠的體重、子宮指數及肝腎功能，DBCP能夠作為安全的天然補充劑長期服用。

2.2 DBCP對骨質疏松大鼠血清相關指標的影響

骨質疏松可能會對大鼠血清中與骨轉換相關的一系列生化指標產生影響，為呈現DBCP作用效果，對各組大鼠的血清相關生化指標進行了檢測分析。

2.2.1 DBCP對大鼠堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活力的影響 ALP是衡量成骨細胞活性的重要指標，具體的DBCP對大鼠ALP活性的影響見圖7。結果顯示：與假手術組相比，陰性對照組大鼠的ALP酶活力呈現極顯著提升（P＜0.01），添加受試樣品后，＜1 kDa、1～3 kDa、＞3 kDa三個分子量的DBCP高劑量組與陰性對照組相比，均呈現極顯著性降低（P＜0.01），與假手術組的ALP活性處于同一水平。此研究結果與Zhang等[18]的研究結論相一致，主要原因為去卵巢后雌激素減少，使得骨吸收亢進，出現代償性骨形成增加，而飼喂DBCP干預后，代償性反應減弱，抑制了破骨細胞活性，抑制了骨吸收，從而使得ALP活性降低。

圖7 DBCP對大鼠ALP酶活力的影響Fig.7 Effect of DBCP on ALP activity in rats

2.2.2 DBCP對大鼠腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF-α）的影響 TNF-α能夠刺激破骨細胞的形成，反應骨吸收狀況。圖8顯示了DBCP對大鼠TNF-α活性的影響。與假手術組相比，陰性對照組大鼠的TNF-α酶活力呈現極顯著提高（P＜0.01），說明去卵巢后骨吸收功能增強，骨形成增加，骨代謝處于高轉換的狀態，這也反映出去卵巢手術能夠誘導高骨轉換型骨質疏松癥的形成。添加受試樣品后，＜1、1～3、＞3 kDa三個分子量的DBCP高劑量組與陰性對照組均有顯著性差異（P＜0.05），證明三種分子量的高劑量DBCP均能夠抑制去卵巢后代謝失衡對于骨吸收和骨形成的提高作用，緩解去卵巢后的高骨轉換癥狀和骨質疏松癥狀。此結果與DBCP對大鼠ALP活力的影響相呼應。

圖8 DBCP對大鼠TNF-α活力的影響Fig.8 Effect of DBCP on TNF-α activity in rats

2.2.3 DBCP對大鼠雌二醇（Estradiol，E2）含量的影響 相關研究表明[19]，雌二醇（E2）水平的降低，會造成骨轉換平衡的打破，最終使骨鈣代謝成為負平衡，骨量減少。在本研究中，分別檢測了各組大鼠的E2含量變化，如圖9所示。與陰性對照組相比，雖然各受試樣品組E2均有不同程度的提高，但經統計學分析，均無顯著性差異（P＞0.05），這表明DBCP對骨質疏松大鼠E2單一指標的作用不明顯。

圖9 DBCP對大鼠E2含量的影響Fig.9 Effect of DBCP on E2 Content in rats

2.2.4 DBCP對大鼠血鈣、血磷含量的影響 血鈣和血磷是與骨礦化有關的指標。如圖10所示，與假手術組相比，陰性對照組大鼠的血鈣和血磷含量均呈現顯著性降低（P＜0.05）；而與陰性對照組相比，＜1 kDa DBCP和1～3 kDa DBCP組的血鈣和血磷含量則均呈現出顯著性升高（P＜0.05）。這表明：＜1 kDa DBCP和1-3 kDa DBCP對于骨質疏松大鼠有較好的提高其體內鈣、磷水平，促進鈣、磷沉積，增強體內成骨細胞增殖的作用，此研究結果與Liu等[11]的研究相一致。

圖10 DBCP對大鼠血鈣和血磷含量的影響Fig.10 Effects of DBCP on blood calcium and phosphorus content in rats

2.3 DBCP對骨質疏松大鼠骨指標的影響

2.3.1 DBCP對大鼠骨組織形態學的影響 圖11反映了各組大鼠脛骨的組織形態學變化，可以看出假手術組大鼠脛骨骨小梁是完整的網狀結構，且結構較為緊密。而摘除卵巢后的陰性對照組大鼠的骨小梁數目明顯減少，且網狀結構不完整，骨小梁間的空隙也明顯變大，另外脛骨部分區域還出現了骨質斷裂的現象，這是骨質疏松的典型病變。而在飼喂DBCP的各組大鼠中，與陰性對照組相比，其結構得到了一定的恢復，骨連接狀態有所好轉，間隙更小，無骨質斷裂等狀況，說明DBCP對改善骨質疏松癥狀具有一定的作用。

圖11 DBCP對大鼠骨組織形態學的影響Fig.11 Effects of DBCP on bone histomorphology in rats

2.3.2 DBCP對大鼠骨密度（Bone mineral density，BMD）的影響 BMD是骨質疏松癥的重點考察指標[20-21]，為使BMD數據更具代表性，分別對各組大鼠的總股骨、股骨前端、股骨骨干及骨骺端4個部位進行了BMD數據測定，具體結果見表3。可以看出，與陰性對照組相比，除＞3 kDa 2% DBCP組外，其余各樣品組的BMD均顯著性升高（P＜0.05），其中＜1 kDa DBCP和1～3 kDa DBCP的兩個劑量組BMD與假手術組間已無顯著性差異（P＞0.01），即＜1 kDa DBCP和1～3 kDa DBCP可使去卵巢大鼠BMD恢復至未去除卵巢水平，即能有效的緩解骨質疏松癥狀。而＞3 kDa 2% DBCP作用效果不明顯可能與肽純度及分子量相對較大有關，影響到了肽的消化吸收效率；而增加劑量至4%時，伴隨著劑量的增加，肽的吸收起到了一定的累積，達到了作用效果。

表3 DBCP對大鼠BMD的影響Table 3 Effect of DBCP on BMD in rats

3 結論

本研究以動物體內實驗的形式探究了不同分子量的DBCP對骨質疏松大鼠的改善作用。結果表明：各實驗組大鼠生長活動良好，肝腎功能等指標均未見異常，表明DBCP作為天然產物無明顯副作用；三種分子量（＜1 kDa、1～3 kDa、＞3 kDa）的高劑量組（4%）DBCP均能夠不同程度下調血清中ALP酶活力和TNF-α的含量，即能夠抑制去卵巢后由于代謝失衡對于骨吸收和骨形成的提高作用，緩解去卵巢后的高骨轉換癥狀和骨質疏松癥狀；＜1 kDa DBCP和1～3 kDa DBCP對骨質疏松大鼠有較好的提高其體內鈣、磷水平的作用，并可使去卵巢大鼠BMD恢復至未切除卵巢水平，即能夠有效地緩解骨質疏松癥狀。

本研究結果的提出，充分論證了驢骨膠原蛋白肽緩解骨質疏松的功效作用，豐富了骨膠原蛋白肽的功效研究成果，并為驢骨膠原蛋白肽類產品的開發及功能宣稱提供了理論依據。但同時膠原蛋白肽在推廣應用及產品開發方面也面臨著一些問題，例如：不同分子量的膠原蛋白肽與功效間的關系、不同來源的膠原蛋白肽的功效研究論證以及法規標準建設不健全等。雖然存在著一些問題，但伴隨著肽制備及分離純化工藝的逐步成熟、新技術研究手段的升級以及相關法規標準的完善，膠原蛋白肽仍具有較廣闊的發展空間。