USP6基因重排在診斷結(jié)節(jié)性筋膜炎中的應(yīng)用

蒲 霞，葉秀峰

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院/重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室，重慶 400016)

結(jié)節(jié)性筋膜炎(NF)是一種發(fā)生在深、淺筋膜，以纖維母細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞增生為主的自限性良性腫瘤[1]，因其梭形腫瘤細(xì)胞生長活躍、有的區(qū)域腫瘤細(xì)胞異常豐富、細(xì)胞核分裂象較多見、組織變異性大等特征，極易被誤診，甚至是被過度診斷為肉瘤，常被作為會診病例進(jìn)行討論[2-3]。大多數(shù)NF并無明確的病因，臨床醫(yī)生在追溯其病史時，少數(shù)可得到其外傷史。由于臨床表現(xiàn)為皮下快速生長的腫塊，偶有病例出現(xiàn)向周圍及周邊組織浸潤，這令外科醫(yī)生十分擔(dān)憂。該病一般通過外科手術(shù)切除后治愈，復(fù)發(fā)病例罕見，LU等[4]報道的272例NF病例中僅出現(xiàn)1例復(fù)發(fā)。因此，若被診斷為NF的病例在術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)有復(fù)發(fā)者，為防止最初診斷出現(xiàn)誤診，需重新慎重評估。

免疫組織化學(xué)在診斷病理學(xué)的廣泛應(yīng)用解決了很多過去形態(tài)特征相似但單純依靠形態(tài)學(xué)難以鑒別的不同病變。此前，NF尚沒有比較特異的免疫組織化學(xué)標(biāo)志物，其診斷主要還是依靠病理形態(tài)學(xué)和臨床表現(xiàn)。2011年，有學(xué)者首次通過熒光原位雜交(FISH)發(fā)現(xiàn)在48例NF患者中有42例發(fā)生泛素特異性蛋白酶6(USP6)基因重排，同時通過RT-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)證實有65%的NF發(fā)生MYH9-USP6基因融合[5]。國內(nèi)外其他學(xué)者也通過類似方法在NF病例中發(fā)現(xiàn)USP6基因重排及MYH9-USP6基因融合，且出現(xiàn)恒定、一致的表達(dá)[2，6]。基于上述分子遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)，有學(xué)者提出可將USP6基因重排檢測作為一種診斷NF的輔助手段。

本研究將基于前面學(xué)者的研究，通過復(fù)習(xí)相關(guān)NF病例，進(jìn)一步了解NF的臨床及組織學(xué)特征，同時利用FISH技術(shù)分析USP6基因重排在NF中的發(fā)生率,以進(jìn)一步確定USP6基因重排在診斷NF中的使用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 從重慶醫(yī)科大學(xué)病理診斷中心2012—2020年所診斷的NF病例中選取30例納入研究組，另收集侵襲性纖維瘤病和未分化肉瘤各4例作為對照組，以上病例均由具有豐富經(jīng)驗的病理學(xué)教授重新進(jìn)行組織學(xué)評估，標(biāo)本均為10%甲醛固定，石蠟包埋組織，以3～4 μm厚度連續(xù)切片置于黏附性載玻片上，放入56～65 ℃干燥箱中烤片2 h后，移出放置冷卻備用。

1.2方法

1.2.1FISH分析方法 (1)脫蠟：將準(zhǔn)備好的石蠟切片組織置于68 ℃脫蠟劑中脫蠟15 min。(2)水化：依次采用二甲苯2×3 min，1∶1的二甲苯和100%乙醇3 min，100%乙醇2 min，95%乙醇2 min，70%乙醇2 min。(3)消化：滴加胃蛋白酶于組織區(qū)域在37 ℃濕盒中消化20 min。(4)洗滌：室溫洗滌液選擇轉(zhuǎn)膜緩沖液2×SSC漂洗2次，每次時間為5 min。(5)脫水：在室溫使用70%、85%和100%梯度乙醇各2 min，室溫晾干。(6)雜交：在腫瘤區(qū)域加入USP6探針(安必平公司提供)，蓋玻片封片，生膠封片，置于37 ℃溫箱中雜交變性過夜。(7)雜交后洗滌：將恒溫箱中的玻片取出放置于清洗液中清洗15 min，清水洗去清洗液，放置干燥。(8)染色：取200 μL復(fù)染溶液(DAPI染液)滴加在玻片標(biāo)本上，自然晾干，蓋上蓋玻片。

1.2.2熒光顯微鏡觀察 將處理好的標(biāo)本置于熒光顯微鏡下觀察，先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂象的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，觀察FISH信號時每例計數(shù)50個無重疊、帶有完整信號(正常和異常信號)的細(xì)胞核，紅色和綠色信號間隔大于2個信號點直徑距離即視為陽性細(xì)胞，超過15%的細(xì)胞核帶有分離信號即認(rèn)為是陽性。用已知USP6陽性的NF作為FISH陽性對照(由購買試劑的公司提供)。

2 結(jié) 果

2.1臨床特點 本研究選取的30例NF患者多數(shù)病史較短，一般為2～3周，少數(shù)為2～3個月，個別長達(dá)8～9個月。患者多為青壯年，年齡主要分布在17～54歲，最小年齡為5歲。發(fā)病無明顯性別差異。除1例患者述有腫塊部位外傷史外，其余均無明顯病因。30例患者均發(fā)現(xiàn)有腫物，腫物直徑為1～3 cm，均為單發(fā)結(jié)節(jié)，好發(fā)部位為上肢、頭頸部、下肢，所選病例通過外科手術(shù)切除腫塊后均治愈，經(jīng)隨訪，均無復(fù)發(fā)。見表1。

表1 NF臨床特征及分子學(xué)特點

2.2組織病理學(xué)特點 本研究所選擇的NF病例在組織學(xué)表現(xiàn)上具有以下共同特征：(1)梭形纖維母細(xì)胞呈不規(guī)則的束狀或交織狀排列，細(xì)胞異型性小，核呈圓形、卵圓形，染色淡，可見小核仁，核分裂象較多見，但無不典型核分裂象。(2)部分區(qū)域間質(zhì)疏松，黏液變，纖維母細(xì)胞周圍有許多小裂隙，有時擴(kuò)展成小囊狀，似漁網(wǎng)狀，黏液可充滿上述小裂隙中，形成NF特有的疏松“羽毛狀”結(jié)構(gòu)，使得纖維母細(xì)胞看起來似組織培養(yǎng)中的纖維母細(xì)胞。(3)間質(zhì)內(nèi)可見紅細(xì)胞外滲及淋巴細(xì)胞浸潤，或形成滲出性微小出血灶。見圖1。

2.3免疫組織化學(xué)結(jié)果 NF大多數(shù)病例中梭形腫瘤細(xì)胞表達(dá)SMA、Calponin、CD10、Vimentin；不表達(dá)CK、Desmin、S-100、β-catenin。但這些免疫組織化學(xué)標(biāo)志物對診斷NF不具有特異性，僅可作為腫瘤起源的大致參考，或排除某些具有相似形態(tài)學(xué)特征的其他軟組織病變。

2.4FISH檢測結(jié)果 30例NF患者通過FISH檢測均出現(xiàn)紅綠信號分離，證明發(fā)生USP6基因重排(30/30)，4例侵襲性纖維瘤病和4例未分化肉瘤未出現(xiàn)紅綠信號分離，即USP6基因重排為陰性。FISH檢測USP6基因的敏感度為100%，特異度為100%。見圖2。

A：NF大量增生的梭形細(xì)胞排列無定向，部分呈束狀，席紋狀[蘇木精-伊紅(HE),4×];B：NF部分區(qū)域間質(zhì)疏松，黏液變(HE,10×);C：NF間質(zhì)內(nèi)大量紅細(xì)胞外滲(HE,4×)。

NF患者FISH檢測出現(xiàn)信號分離。

3 討 論

NF作為一種常見的軟組織病變，最常見的好發(fā)部位為上肢(尤其是前臂)，其次是軀干、頭頸部、下肢[7]，不常見的部位如關(guān)節(jié)內(nèi)[8]、乳腺[9]、外陰[10]、口腔[11]等也有報道。該病可發(fā)生在任何年齡，但20～50歲較多見，兒童及老年人較少見[7]。NF起病較急，通常表現(xiàn)為迅速增大的皮下腫物。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，此腫瘤在未進(jìn)行就診的情況下，就有自然消退的傾向[12]。目前NF的治療方式多為手術(shù)切除腫塊，術(shù)后復(fù)發(fā)極罕見(<2%)[7]，且認(rèn)為復(fù)發(fā)的病例多因手術(shù)未切除干凈或誤診所致[13]。本研究中無一例復(fù)發(fā)。在形態(tài)學(xué)上，NF由于腫瘤細(xì)胞豐富，細(xì)胞增生活躍，核分裂象易見，某些病例甚至可見到奇異、巨核細(xì)胞，組織學(xué)亞型多，變異性大，與其他軟組織病變的組織形態(tài)學(xué)有很多重疊，又無特異的免疫組織化學(xué)標(biāo)記，缺乏經(jīng)驗的病理醫(yī)生易將其誤診為低級別肉瘤[14]。本研究的30例NF病例中，其中有3例來自于基層醫(yī)院提交的會診，起初的病理診斷中均未考慮NF，可見病理醫(yī)生對NF的認(rèn)識還存在不足。1955年，有病理學(xué)家首次把這種病變稱為“皮下組織的假肉瘤性纖維瘤病”[15]，此后臨床對NF的病變性質(zhì)一直存在著爭議。2011年，有學(xué)者首次通過FISH發(fā)現(xiàn)在有90%以上的NF涉及有USP6基因染色體易位(17p13)，并證實其伙伴基因為MYH9，由此提出NF是一種具有自限性的一過性良性腫瘤[5]。緊接著AMARY等[16]也得出相同的試驗數(shù)據(jù)。截至目前報道的NF病例中，MYH9是報道最多的一個USP6伴侶基因，65%～74%的NF患者存在MYH9 USP6融合，其位于染色體22q12.3，屬非肌球蛋白Ⅱ類家族成員之一，參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞運動和維持細(xì)胞形狀等，USP6基因的編碼區(qū)與MYH9伴侶基因非編碼啟動子區(qū)域結(jié)合，從而提高了USP6全編碼序列的轉(zhuǎn)錄活性[5]。另有研究在NF中檢測到一系列新的伴侶基因，包括RRBP1、CALU、CTNNB1、MIR22HG、SPARC、THBS2、COL6A2、SERPINH1、COL3A1、EIF5A[17-18]，但上述USP6融合基因與NF的臨床關(guān)系尚不明確。但值得注意的是，2016年1例NF病例中檢測到PPPR6-USP6基因融合及擴(kuò)增，該病例在10年時間內(nèi)多次復(fù)發(fā)，并最終轉(zhuǎn)移為惡性[13]。2019年在1例男性的NF病例中再次檢測到相同的融合基因和擴(kuò)增，該病例顯示出長達(dá)2年的浸潤性生長，但在廣泛切除術(shù)后隨訪的1年時間內(nèi)暫未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[19]，但該融合基因是否與NF的侵襲行為有關(guān)還需要更多的病例證實。有報道提及，極少的NF病例發(fā)生USP6基因缺失[20]，但缺失機(jī)制尚不清楚，因此在病理診斷工作中遇到缺失信號時，為避免漏診，需要特別注意，可將此信號視為不典型陽性信號或結(jié)合RT-PCR檢測進(jìn)而作出更準(zhǔn)確的判斷。

USP6位于第17號染色體p13位點上，該基因?qū)儆谌シ核鼗傅囊粋€大亞家族，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，炎癥信號傳導(dǎo)和DNA損傷修復(fù)等多種生理活動[5，21]，首次在尤因肉瘤基因轉(zhuǎn)染試驗中被鑒定為致癌基因[22]。2004年，OLIVEIRA等[23]在動脈瘤樣骨囊腫中發(fā)現(xiàn)USP6基因染色體易位，并證實其伙伴基因為CDH11等，接著ERICKSON-JOHNSON等[5]首次在NF中也發(fā)現(xiàn)該基因存在高度表達(dá)。自發(fā)現(xiàn)USP6基因易位以來，越來越多的人認(rèn)為這2種實體都是腫瘤過程的再現(xiàn)，并且考慮NF在未進(jìn)行治療的情況下有自發(fā)消退的趨勢，提出了一個新的概念：“暫時性腫瘤形成”[5]。除了上述這2種實體腫瘤外，新近報告顯示，某些發(fā)生在手足的富于細(xì)胞腱鞘纖維瘤也出現(xiàn)USP6基因重排，而且在形態(tài)學(xué)上與NF極其相似，但在經(jīng)典的腱鞘纖維瘤則未出現(xiàn)USP6基因易位，這可能提示富于細(xì)胞腱鞘纖維瘤可能是發(fā)生于手足的NF，是未被充分認(rèn)識的變異體[24]。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道，USP6基因重排還出現(xiàn)在骨化性肌炎[25]、顱筋膜炎[26]、手指纖維骨性假瘤[27]及動脈瘤樣骨囊腫的一個子集(手部和足部巨細(xì)胞修復(fù)性肉芽腫)中[28]，但FISH在NF樣的反應(yīng)性病變或修復(fù)性肌纖維母細(xì)胞增生性病變中均未檢測到USP6基因重排，這提示USP6基因重排的相關(guān)檢測有助于這類疾病的鑒別診斷[29]。本研究中，F(xiàn)ISH試驗結(jié)果也符合先前學(xué)者的研究，所選NF病例均存在USP6基因重排，且USP6基因重排具有較高的敏感度及特異度。參考之前國內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)論，提示在今后的病理日常工作中，可以把USP6基因重排檢測作為診斷NF的一種重要輔助手段，特別是某些活檢組織小、形態(tài)學(xué)上診斷困難的病例。當(dāng)然，F(xiàn)ISH試驗中石蠟切片的厚度、加入探針前預(yù)處理的好壞、消化酶處理的時間及雜交時間均會客觀地影響熒光信號的顯示，另外熒光信號的觀察判讀要求也較高，需要同時具備分子遺傳學(xué)和組織形態(tài)學(xué)知識且擁有豐富工作經(jīng)驗的病理醫(yī)生來完成。因此，醫(yī)生在進(jìn)行USP6陽性或者陰性的診斷時需格外謹(jǐn)慎，在用其輔助診斷NF時必須結(jié)合其組織形態(tài)學(xué)，不能僅僅依靠USP6陽性或者陰性而確定或否定對NF的診斷，病理醫(yī)生應(yīng)足夠熟悉其多變的形態(tài)學(xué)特點，結(jié)合相應(yīng)的輔助手段用以鑒別診斷NF。

近年來，分子病理與組織病理相互結(jié)合和聯(lián)系越來越密切，在很多疾病的診斷和靶向治療方面發(fā)揮著越來越重要的作用，很多軟組織腫瘤存在克隆性的細(xì)胞和分子遺傳學(xué)異常，表現(xiàn)為染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常及相應(yīng)基因的突變、擴(kuò)增，或染色體異位及產(chǎn)生融合基因等，在軟組織腫瘤的診斷、鑒別診斷、預(yù)后判斷及相應(yīng)的靶向治療方面發(fā)揮著重要作用。而NF的分子遺傳學(xué)特征則為病理診斷提供了一個新方向。