誘導(dǎo)痰生物標(biāo)志物在哮喘-COPD重疊綜合征中的應(yīng)用

滕飛 胡波

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林 吉林 132001)

哮喘-慢性阻塞性肺疾病(COPD)重疊綜合征(ACOS)是一種常見(jiàn)的慢性氣道疾病。目前對(duì)于ACOS的研究尚少，但不能根據(jù)患者的肺功能檢查、人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和痰細(xì)胞計(jì)數(shù)或肺部影像學(xué)來(lái)明確診斷ACOS〔1〕，因此亟待建立一種診斷ACOS的標(biāo)準(zhǔn)及方法。盡管哮喘和COPD的炎癥通路明顯不同，但在ACOS中相一致，痰液中的嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞是ACOS的特征。由于機(jī)體對(duì)誘導(dǎo)痰的影響較小，因此誘導(dǎo)痰中的炎癥因子含量可反映肺的局部炎癥及氣道阻塞等情況。文獻(xiàn)報(bào)道，白細(xì)胞介素(IL)-13是在嗜酸性粒細(xì)胞炎癥和哮喘中重要的T輔助2型標(biāo)志物〔2〕。IL-6水平與肺功能受損相關(guān)，且在ACOS患者中檢測(cè)到升高的血清IL-6水平〔3〕。髓過(guò)氧化物酶(MPO)和嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)在ACOS中與嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥和(或)氣道上皮損傷有關(guān)〔4〕。本研究進(jìn)一步觀察上述炎癥因子在ACOS、COPD和哮喘患者誘導(dǎo)痰中的含量水平。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 2019年1月至2020年1月就診于水華大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科的住院患者篩選30例ACOS急性加重期患者(ACOS組)，按照年齡、性別及體重指數(shù)匹配的原則篩選出同期住院的30例單純哮喘急性發(fā)作期患者(哮喘組)和30例單純COPD急性加重期患者(COPD組)及在體檢中心選擇無(wú)呼吸系統(tǒng)疾患的健康者20例作為正常組。ACOS診斷標(biāo)準(zhǔn)是2015年GOLD指南ACOS(5步法)診斷標(biāo)準(zhǔn)，哮喘患者診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組制定的《支氣管哮喘防治指南》(2008年版)，COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)是中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢阻肺學(xué)組制定的《COPD診治指南2013年修訂版》。為避免吸煙對(duì)氣道阻力的影響，所有入選病例不吸煙，同時(shí)排除嚴(yán)重心、肝、腎等其他相關(guān)疾病。本研究得到本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象對(duì)本研究知情并簽署知情同意書(shū)。4組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

1.2一般情況采集及肺功能測(cè)定 采集研究對(duì)象年齡、性別、身高、體重指數(shù)(BMI)，測(cè)定肺功能包括第1秒用力呼氣量占呼氣量比例(FEV1%)、用力肺活量(FVC%)。

1.3誘導(dǎo)痰樣本采集及炎癥因子檢測(cè) 按照文獻(xiàn)方法〔5〕，痰誘導(dǎo)前讓研究對(duì)象吸入沙丁胺醇200 μg，15 min后超聲波霧化器吸入3%無(wú)菌高滲鹽水，霧化時(shí)間5～10 min，誘導(dǎo)咳出痰，收集于無(wú)菌干燥培養(yǎng)皿中，挑選出黏液部分加入4倍體積的0.1% 二硫蘇糖醇(DTT)，37℃恒溫培養(yǎng) 30 min，懸浮液渦旋振蕩30 s，再用4倍體積的磷酸鹽緩沖鹽水稀釋，然后以1 000 r/min離心10 min,收集上清液并儲(chǔ)存在-70℃環(huán)境下。按照特異性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒測(cè)定誘導(dǎo)痰中IL-13、IL-6、MPO和NGAL。

1.4誘導(dǎo)痰中炎癥細(xì)胞檢測(cè) 誘導(dǎo)痰離心沉渣制備痰細(xì)胞學(xué)涂片2張，室溫下自然風(fēng)干,做蘇木素-伊紅(HE)染色。光學(xué)顯微鏡下行細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類，每張片至少計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞,分類計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞,兩張涂片取其平均數(shù),得出各種細(xì)胞所占百分率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD法。

2 結(jié) 果

2.1研究對(duì)象人口學(xué)特征及肺功能測(cè)定結(jié)果 ACOS、哮喘、COPD組肺功能參數(shù)均低于正常組，尤以COPD組降低明顯，ACOS 組次之(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組人口學(xué)特征及肺功能比較

2.24組誘導(dǎo)痰中細(xì)胞總數(shù)及分類比較 ACOS、哮喘、COPD組誘導(dǎo)痰細(xì)胞總數(shù)高于正常組，差異顯著(P<0.05),但3組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。細(xì)胞分類看，ACOS、哮喘、COPD組以嗜酸性和中性粒細(xì)胞為主，正常組以巨噬細(xì)胞為主。與正常組相比，嗜酸性粒細(xì)胞百分比以哮喘患者最高，中性粒細(xì)胞以COPD組最高，但ACOS和COPD組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組誘導(dǎo)痰中細(xì)胞總數(shù)及分類比較

2.34組誘導(dǎo)痰中炎癥因子比較 與正常組比較，其余3組誘導(dǎo)痰中炎癥因子IL-6、IL-13、NGAL和MPO水平均增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ACOS、COPD組IL-6、IL-13和MPO水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4組誘導(dǎo)痰中炎癥因子比較

3 討 論

既往認(rèn)為支氣管哮喘和COPD為不同的氣道炎癥引起的兩種疾病，研究表明，誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類計(jì)數(shù)可以客觀、快速地反映肺部炎癥情況〔6〕，因該方法具有經(jīng)濟(jì)、無(wú)創(chuàng)、快速、可靠等優(yōu)勢(shì)，使其在呼吸系統(tǒng)鑒別和臨床判斷療效上得到一定應(yīng)用。

研究發(fā)現(xiàn)COPD患者痰中的細(xì)胞主要是中性粒細(xì)胞，呼吸道中的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度達(dá)70%，支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞數(shù)量是正常人的2～3倍〔7〕。哮喘患者氣道炎癥以嗜酸性粒細(xì)胞為主，且其增高水平與哮喘嚴(yán)重程度呈正相關(guān)〔8〕。本研究中結(jié)果提示急性期氣道炎癥活動(dòng)增強(qiáng)。哮喘患者痰嗜酸性粒細(xì)胞水平明顯高于ACOS和COPD患者，可作為哮喘患者的鑒別診斷指標(biāo)。但ACOS和COPD患者痰嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此不可以作為ACOS急性加重與COPD急性發(fā)作的鑒別診斷。此結(jié)論與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相矛盾，劉凌云等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)ACOS組誘導(dǎo)痰嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于COPD組，且誘導(dǎo)痰嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在診斷ACOS中的敏感度和特異度均達(dá)80%以上，認(rèn)為嗜酸粒細(xì)胞檢查可以作為診斷ACOS的重要觀察指標(biāo)，Kitaguchi 等〔10〕發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定期ACOS患者痰液中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量明顯高于單純COPD患者。分析其原因可能與所選取的患者個(gè)體特征、疾病所處時(shí)期及樣本量多少有關(guān)。

IL-6是一種多功能炎癥細(xì)胞因子，參與COPD的氣道炎癥和氣道重塑〔11〕，Du等〔12〕報(bào)道中重度COPD 患者誘導(dǎo)痰液中IL-6顯著增高。IL-13可以通過(guò)促進(jìn)杯狀細(xì)胞增生來(lái)增強(qiáng)黏液分泌，改善黏液分泌以增加氣道壁〔13〕。符丹丹等〔14〕研究顯示,COPD患者外周血IL-13水平在急性發(fā)作期升高,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-13過(guò)度表達(dá)可使大鼠肺容積增大,黏液分泌增多〔15〕，表明IL-13參與了COPD的炎癥形成過(guò)程。本研究結(jié)果說(shuō)明IL-6、 IL-13參與了氣道炎癥反應(yīng)，但ACOS和COPD患者之間IL-6和IL-13無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。最近一項(xiàng)研究顯示ACOS患者中檢測(cè)到血清IL-6水平升高，同樣血清IL-6水平也不能區(qū)分COPD和ACOS〔16〕。因此關(guān)于IL-6和IL-13與這3種疾病的聯(lián)系有待進(jìn)一步探究。

中性粒細(xì)胞的特點(diǎn)之一是含有大量MPO，主要功能是參與活性氧的生成，而活性氧對(duì)組織具有極強(qiáng)的破壞力。研究顯示哮喘、COPD均存在中性粒細(xì)胞氧化-抗氧化失衡〔17,18〕。 本研究結(jié)果提示ACOS和哮喘、COPD患者氣道存在氧化能力增強(qiáng)，與高瞻等〔19〕研究結(jié)果相似，但ACOS和COPD兩者的氧化能力無(wú)顯著差異。說(shuō)明MPO也不能作為鑒別ACOS和COPD的生物標(biāo)志物。

NGAL是由中性粒細(xì)胞和一些上皮細(xì)胞分泌的微量蛋白，文獻(xiàn)報(bào)道NGAL可作為研究慢性肺病的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物〔20〕。且當(dāng)機(jī)體處于感染時(shí)，骨髓和上皮細(xì)胞的toll樣受體可激活而分泌NGAL，因此，痰NGAL水平可能與氣道炎癥和微生物定植有關(guān)。由于ACOS患者似乎比哮喘和COPD更頻繁的惡化，而微生物感染是惡化的主要病因之一，這使ACOS患者NGAL水平明顯增高；另一方面，當(dāng)氣道發(fā)生炎癥時(shí)，多種炎癥因子被激活如腫瘤壞死因子α、IL-8等，這些炎癥因子也可促進(jìn)NGAL表達(dá)〔21〕。本研究結(jié)果表明ACOS患者的痰NGAL水平顯著高于哮喘和COPD組也支持了上述觀點(diǎn)，因此痰NGAL可能是ACOS的一個(gè)特征，可作為哮喘和COPD患者中鑒別ACOS的一個(gè)重要生物標(biāo)志物。

雖然本研究中檢查誘導(dǎo)痰的生物標(biāo)志物可能與其他疾病相關(guān)，但使用痰液可能會(huì)提高其對(duì)氣道疾病的特異性。 痰生物標(biāo)志物水平的變化可能反映了氣道疾病發(fā)展過(guò)程中細(xì)胞組成和功能的變化。