積雪草酸通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制A549細胞的增殖和遷移

王子健 莊作會 劉春霞

(1山東第一醫科大學研究生部，山東 濟南 250118；濟寧市中西醫結合醫院 2肺病脾胃病科；3腫瘤科)

肺癌屬于死亡率最高的腫瘤之一〔1〕。且非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌患者的80%〔2〕。目前，手術治療、化學治療、放射治療及免疫療法是NSCLC的主要治療方法，由于早期NSCLC患者無特異性臨床體征，多數患者在初診時已處于中晚期，這導致全球NSCLC患者5年生存率僅為18%〔3,4〕。因此，迫切需要尋找更有效的治療NSCLC的方法。研究表明，中草藥具有廣泛的抗癌作用和低副作用，越來越多的中草藥被單獨使用或與經典的抗癌藥物聯合作用，從而預防甚至治療癌癥〔5〕。積雪草酸(AA)是一種天然存在的五環三萜類化合物，存在于許多植物中，包括積雪草、普氏藻、海棠和桉樹等〔6〕。據研究，AA可以抑制肝癌和鼻咽癌的惡性進展〔7,8〕。機制上，AA可以通過調控Smad3/Smad7信號通路在腫瘤中發揮抑制作用〔9〕。然而AA在NSCLC中的生物學功能及其作用機制尚待研究。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/重組人絲氨酸-蘇氨酸激酶(AKT)1/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路與人類腫瘤的發生和發展密切相關〔10,11〕。據研究，PI3K/AKT/mTOR信號通路參與NSCLC細胞的生長、增殖和轉移等生物學進程〔12,13〕。然而NSCLC細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路是否受到AA的調控尚不清楚。本研究旨在探討AA對NSCLC細胞增殖和遷移的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人NSCLC細胞A549購自中國典型培養物保藏中心。CCK-8細胞計數試劑盒、RIPA蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒和電化學發光(ECL)顯影試劑盒購自中國碧云天生物技術。相關蛋白的一抗和二抗均購于美國Abcam。

1.2細胞培養與分組 DMEM 培養基培養A549細胞，含 10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素。并置于37℃，5%CO2的飽和濕度的培養箱中培養。每3 d換培養液1次，細胞對數期使用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。將對數期的A549細胞分別用0、10、20、30、40 μg/ml的AA處理，計為Control組、10 μg/ml組、20 μg/ml組、30 μg/ml組和40 μg/ml組。

1.3CCK-8法測定細胞活力 將各組A549細胞以1×105/孔種植于96孔板上。于培養24、48、72、96 h時每孔加入10 μl的CCK-8溶液，將培養板在培養箱內繼續孵育4 h，使用微孔板讀數儀分別測量細胞的光密度OD(450 nm)。

1.4BrdU檢測細胞增殖 將各組A549以按1×105個/孔接種于24孔板。按說明書加入BrdU標記試劑，并將孔板置于5%CO2、37℃培養箱內培養；連續培養細胞共48 h后，按Sigma公司BrdU抗體操作說明進行細胞免疫熒光染色。紅色熒光標記增殖的細胞，藍色熒光標記細胞總數，細胞增殖率=BrdU陽性細胞數/DAPI陽性細胞數，取3個視野細胞增殖率的平均值為細胞的增殖率。

1.5細胞劃痕實驗檢測細胞遷移 將各組A549細胞制成細胞懸液，以1×106/ml的密度種植于6孔培養板中，待細胞鋪滿后，用槍頭垂直于培養板劃線。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基，并使用AA(0、10、20 μg/ml)溶液處理，于37℃，5%CO2環境下培養。于0、24 h取樣、拍照。

1.6Western印跡 RIPA溶液對各組A549細胞進行裂解，提取細胞總蛋白。用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白質樣本的濃度。使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白提取物分離后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%牛血清白蛋白(BSA)處理膜室溫1 h阻斷非特異性結合，并與相關的一抗孵育12 h，然后用二抗室溫孵育1 h。使用ECL顯示蛋白質信號，Image J軟件分析蛋白條帶。

1.7統計學分析 采用SPSS26.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1AA對A549細胞活力的影響 在24、48、72 h隨著AA濃度的增加，細胞活力逐漸降低(P<0.05)。見表1。后續實驗將采用10、 20 μg/ml AA進行研究。

表1 CCK-8法檢測AA對A549細胞活力變化

2.2AA對A549細胞增殖的作用 與Control組BrdU細胞陽性率〔(79.73±9.46)%〕相比，10 μg/ml組和20 μg/ml組〔(57.91±6.92)%、(27.83±4.06)%〕均顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 BrdU檢測A549細胞的增殖(免疫熒光，×400)

2.3AA對A549細胞遷移能力的影響 與Control組A549細胞劃痕的愈合程度〔(72.35±8.42)%〕相比，10 μg/ml組和20 μg/ml組〔(49.36±7.98)%、(31.04±8.25)%〕顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 細胞劃痕實驗檢測A549細胞的遷移

2.4AA對A549細胞上皮間質轉化(EMT)的影響 與Control組相比，10 μg/ml組和20 μg/ml組血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶(MMP)-14、波形蛋白表達均顯著降低，見圖3、表2。

表2 Western印跡檢測EMT相關蛋白表達的變化

圖3 Western印跡檢測EMT相關蛋白表達的變化

2.5AA對A549細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響 與Control組相比，10 μg/ml組和20 μg/ml組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的表達水平均顯著降低(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 Western印跡檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白的表達

表3 Western印跡檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白的表達

3 討 論

研究證實中草藥在多種惡行腫瘤中具有顯著的抗癌作用〔14～16〕。研究報道AA通過抑制多耐藥基因(MDR)1誘導人肺腺癌A549/DDP細胞對順鉑(DDP)敏感，并通過PI3K/AKT信號通路抑制(WAVE)3的活化抑制乳腺癌細胞的侵襲和增殖〔17,18〕。AA可以通過破壞線粒體的結構在體外和體內抑制肺癌的生長〔19〕。研究表明，AA可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號傳導途徑抑制人結腸癌細胞的增殖和遷移，并誘導其凋亡〔20〕。

EMT是指上皮性質的細胞出現了間質細胞的特性，從而促進細胞的遷移、侵襲和浸潤〔21〕。VEGF能促進血管通透性增加和血管形成等作用；MMP-14與腫瘤細胞的遷移、侵襲相關；波形蛋白是中間絲的其中一種蛋白質，其與腫瘤的發生和轉移密切相關〔22～24〕。本研究結果表明AA可參與抑制A549細胞的EMT進程。

PI3K/Akt/mTOR可參與細胞的生理和病理過程，其被異常激活發生磷酸化，從而促進前列腺癌和乳腺癌惡行進展〔25～27〕。研究報道，乙酰紫草素通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路磷酸化抑制結直腸癌生長〔28〕；虎杖苷通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路磷酸化誘導人宮頸癌細胞凋亡〔29〕。而AA可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路磷酸化在人卵巢癌細胞中發揮抑癌作用〔30〕。

本研究表明，AA可抑制A549細胞的增殖活力；降低細胞遷移能力;抑制VEGF、MMP-14、和Vimentin蛋白的表達；進一步研究表明AA可抑制p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表達。