仙鶴草提取物調控miR-34c-5p表達對鼻咽癌細胞增殖、凋亡的影響及其機制

王曼 宋智斌

(1邢臺市人民醫院耳鼻咽喉科，河北 邢臺 054001；2邢臺市信都區中心醫院內科)

鼻咽癌是起源于鼻咽黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，據統計全世界每年有5萬人死于鼻咽癌，其中大多數患者來自中國南部和東南亞地區〔1〕。目前，放化療是鼻咽癌患者的主要治療方法，但由于晚期患者放化療耐受及并發癥的出現嚴重影響治療效果，患者的5年生存率仍不理想〔2〕。因此，尋找安全、高效、低毒的抗腫瘤藥物，提高臨床鼻咽癌治療效果是目前亟待解決的重大課題。仙鶴草又名龍牙草，為薔薇科多年生草本植物，具有收斂止血，止痢殺蟲、強心益氣之功效，多用于治療各種出血和脫力勞傷等〔3〕。研究發現〔4〕，仙鶴草具有較好的抗腫瘤活性，如仙鶴草水提液可顯著抑制肺癌細胞A549增殖，誘導細胞凋亡；仙鶴草丙酮提取物正丁醇萃取層可誘導肝癌細胞BEL-7402內活性氧增加，促進細胞凋亡〔5〕，此外一定濃度的仙鶴草提取物對鼻咽癌有抑制作用〔6〕。但仙鶴草對鼻咽癌生物行為影響的具體機制鮮有報道。本研究探討仙鶴草提取物對鼻咽癌細胞增殖抑制和凋亡促進及其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2購于美國ATCC。(DMEM)培養基和胎牛血清購于美國Gibco公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購于Sigma公司；噻唑藍(MTT)試劑盒和AnnexinV-FITC/PI試劑盒購于北京索萊寶公司；Western印跡相關試劑、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購于上海碧云天公司；兔源細胞周期素(Cyclin)D1多克隆抗體、兔源P21單克隆抗體和兔源GAPDH多克隆抗體購于Abcam公司，鼠源B細胞淋巴瘤(Bcl)相關X蛋白(Bax)單克隆抗體、鼠源Bcl-2單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗購于Santa Cruz公司。仙鶴草購于河南國藥堂中藥材批發商行，經醫院中藥房鑒定為仙鶴草。仙鶴草提取物制備參照文獻〔6〕進行。

1.2細胞培養 復蘇CNE1和CNE2細胞后，用含有10%胎牛血清的DMEM培養基在37℃、CO2體積分數為5%、90%濕度的培養箱內分別培養CNE1和CNE2細胞，每隔1 d換液1次。取對數期細胞進行實驗。

1.3細胞處理和分組 將鼻咽癌細胞CNE1和CNE2分隨機分為對照組(未經處理的CNE1或CNE2細胞)、不同濃度(40、60、80 mg/ml)仙鶴草提取物組(用相應濃度的仙鶴草提取物處理細胞48 h)、miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-34c-5p組(轉染miR-34c-5p mimics)、仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC后用60 mg/ml仙鶴草提取物組處理48 h)和仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-34c-5p組(轉染anti-miR-34c-5p后用60 mg/ml仙鶴草提取物組處理48 h)。轉染步驟參照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書。

1.4MTT法檢測細胞活力 將按照1.3分組進行相應處理的CNE1或CNE2細胞接種到96孔板，分別在24 h、48 h、72 h時間點，各取一組細胞，每孔加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，孵育4 h后，棄去培養液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，室溫震蕩10 min，當結晶完全溶解后，酶標儀測定各孔在490 nm波長處吸光值。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡 按照1.3分組進行相應處理的CNE1或CNE2細胞，調整細胞密度為1×106個/ml，取100 μl細胞懸液，加入5 μl的Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育10 min后，加入10 μl的碘化丙啶(PI)染液，繼續孵育5 min，補加磷酸鹽緩沖液(PBS)至500 μl，1 h內進行上機檢測。

1.6qRT-PCR檢測 收集各組CNE1或CNE2細胞，TRIZOL試劑提取總RNA后，紫外分光光度計檢測其濃度和純度。利用逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進行qPCR擴增，以U6為內參，按照2-ΔΔCt公式計算miR-34c-5p的相對表達量。

1.7Western印跡檢測 提取各組CNE1或CNE2細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白樣品轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，Western封閉液室溫封閉1 h后，分別加入抗CyclinD1、P21、Bax和Bcl-2蛋白Ⅰ抗，側擺搖床4℃孵育過夜后，Western洗滌液洗膜，分別加入已稀釋的Ⅱ抗室溫條件孵育2 h，Western洗滌液洗膜后，在暗盒中進行電化學發光(ECL)顯影，以GAPDH為內參，用Quantity One軟件分析各目的條帶灰度值。

1.8統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1仙鶴草提取物對鼻咽癌細胞CNE1和CNE2增殖的影響 與對照組比較，不同濃度的仙鶴草提取物(40、60、80 mg/ml)可顯著抑制CNE1和CNE2細胞的增殖，抑制CyclinD1蛋白表達，促進P21蛋白表達，且呈顯著的濃度依賴性(P<0.05)。選取仙鶴草60 mg/ml進行后續實驗。見表1、表2和圖1。

表1 不同濃度的仙鶴草提取物對細胞CNE1增殖的影響

表2 不同濃度的仙鶴草提取物對細胞CNE2增殖的影響

2.2仙鶴草提取物對鼻咽癌細胞CNE1和CNE2凋亡的影響 與對照組比較，60 mg/ml的仙鶴草提取物可顯著促進CNE1和CNE2凋亡，顯著促進Bax蛋白表達，顯著抑制Bcl-2蛋白表達(P<0.001)。見表3，圖2，圖3。

表3 仙鶴草提取物對細胞CNE1及CNE2凋亡的影響

2.3仙鶴草提取物對細胞CNE1和CNE2中miR-34c-5p表達的影響 與對照組(0.22±0.02、0.23±0.02)比較，60 mg/ml仙鶴草提取物可顯著促進CNE1和CNE2中miR-34c-5p的表達(0.78±0.07、0.66±0.06；t=23.077、20.397，均P=0.000)。

1～4：對照組、仙鶴草40 mg/ml組、仙鶴草60 mg/ml組、仙鶴草80 mg/ml組圖1 不同濃度的仙鶴草提取物對細胞CNE1和CNE2增殖蛋白表達的影響

圖2 流式細胞術檢測仙鶴草提取物對細胞CNE1和CNE2凋亡的影響

圖3 仙鶴草提取物對細胞CNE1和CNE2凋亡蛋白的影響

2.4過表達miR-34c-5p對細胞CNE1和CNE2增殖、凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-34c-5p組CNE1和CNE2中miR-34c-5p的表達量顯著上升(P<0.05)，表明成功構建穩定過表達miR-34c-5p的CNE1和CNE2細胞株。與miR-NC組比較，miR-34c-5p組CNE1和CNE2的增殖活力顯著降低，細胞凋亡率顯著增加，CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達顯著降低，P21和Bax蛋白的表達顯著升高(P<0.05)。提示過表達miR-34c-5p可抑制CNE1和CNE2細胞增殖，促進細胞凋亡。見圖4、表4、5。

表4 過表達miR-34c-5p對細胞CNE1增殖、凋亡的影響

圖4 過表達miR-34c-5p對細胞CNE1和CNE2增殖、凋亡蛋白表達的影響

2.5抑制miR-34c-5p表達能逆轉仙鶴草提取物對細胞CNE1和CNE2的增殖抑制作用 與對照組比較，仙鶴草60 mg/ml組CNE1和CNE2細胞miR-34c-5p和P21蛋白的表達顯著升高，CyclinD1蛋白的表達顯著降低，細胞增殖活力顯著降低；與仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-NC組比較，仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-34c-5p組CNE1和CNE2細胞miR-34c-5p和P21蛋白的表達顯著降低，CyclinD1蛋白的表達顯著升高，細胞增殖活力顯著升高(P<0.05)。表明抑制miR-34c-5p表達能逆轉仙鶴草提取物對細胞CNE1和CNE2的增殖抑制作用。見圖5、表6、7。

表5 過表達miR-34c-5p對細胞CNE2增殖、凋亡的影響

1～4：對照組、仙鶴草60 mg/ml組、仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-NC組、仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-34c-5p組；圖5同圖5 抑制miR-34c-5p表達能逆轉仙鶴草提取物對細胞CNE1和CNE2增殖蛋白表達的影響

表6 抑制miR-34c-5p表達能逆轉仙鶴草提取物對細胞CNE1增殖的影響

表7 抑制miR-34c-5p表達能逆轉仙鶴草提取物對細胞CNE2增殖的影響

2.6抑制miR-34c-5p表達能逆轉仙鶴草提取物對細胞CNE1和CNE2的凋亡的促進作用 與對照組比較，仙鶴草60 mg/ml組CNE1和CNE2細胞Bax蛋白的表達顯著升高，Bcl-2蛋白的表達顯著降低，細胞凋亡率顯著升高；與仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-NC組比較，仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-34c-5p組CNE1和CNE2細胞Bax蛋白的表達顯著降低，Bcl-2蛋白的表達顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。表明抑制miR-34c-5p表達能逆轉仙鶴草提取物對細胞CNE1和CNE2的凋亡促進作用。見圖6、表8。

圖6 抑制miR-34c-5p表達能逆轉仙鶴草提取物對細胞CNE1和CNE2凋亡蛋白表達的影響

表8 抑制miR-34c-5p表達能逆轉仙鶴草提取物對細胞CNE1及CNE2凋亡的影響

3 討 論

仙鶴草的藥理作用主要包括抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、降血糖和免疫增強等〔7〕。其中，仙鶴草的抗腫瘤作用是其研究熱點之一。Nho等〔8〕研究發現，仙鶴草乙醇提取物可激活caspase活性，引起細胞周期G1期阻滯，抑制HepG2細胞增殖，誘導細胞凋亡；Huang等〔9〕在研究骨肉瘤U-2OS細胞對仙鶴提取物治療反應時發現，仙鶴草提取物以濃度依賴性方式抑制細胞活力，通過上調Bax表達增加Bax/Bcl-2比率，引發細胞色素c從線粒體釋放到細胞質，誘導U-2OS細胞凋亡；Wang等〔10〕研究發現，仙鶴草提取物在體內外對S180腫瘤細胞也具有抑制作用；此外，仙鶴草和人參等草本提取物聯用對延長晚期胰腺癌患者生存時間和提高生活質量具有重要意義〔11〕。本研究表明仙鶴草提取物具有抗鼻咽癌作用，能夠有效抑制鼻咽癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。

miR-34家族包括miR-34a、miR-34b和miR-34c，其中miR-34c通過調控細胞周期蛋白依賴激酶CDK4、cMyc及誘導p53表達在多種惡性腫瘤的發展中發揮重要作用〔12〕。miR-34c-5p是成熟的miR-34c，Wang等〔13〕在研究鼻咽癌和慢性鼻咽炎患者差異表達的miRNA時發現，miR-34c-5p表達下調，低水平的miR-34c-5p與鼻咽癌患者晚期TNM分期顯著相關；Luo等〔14〕通過miRNA微陣列分析發現，miR-34c-5p的表達下調可能與鼻咽癌遠端轉移有關；同時，馬菲菲等〔15〕研究證實miR-34c-5p低表達與鼻咽癌細胞的增殖和侵襲能力相關，過表達miR-34c-5p可明顯抑制鼻咽癌細胞的增殖和遷移侵襲能力。本研究結果與上述研究結論一致，即miR-34c-5p在鼻咽癌中發揮抑癌基因作用。

傳統中藥通過調控miRNA表達，增加腫瘤細胞對傳統藥物的敏感性，從而有效抑制腫瘤細胞增殖機制被廣泛報道〔16〕。Wan等〔17〕研究表明，片仔癀通過上調miR-34c-5p表達抑制結直腸癌細胞的增殖。本研究發現，仙鶴草提取物干預可促進miR-34c-5p表達，推測仙鶴草提取物對CNE1和CNE2細胞的增殖抑制和凋亡促進作用可能與上調miR-34c-5p表達有關，于是把miR-34c-5p抑制劑轉染至CNE1和CNE2細胞并用仙鶴草提取物干預處理，發現抑制miR-34c-5p可逆轉仙鶴草提取物對細胞CNE1和CNE2的增殖抑制和凋亡促進作用。提示仙鶴草提取物抑制鼻咽癌細胞增殖，促進細胞凋亡，其作用與上調miR-34c-5p表達有關。