機械敏感分子踝蛋白-1在動脈粥樣硬化小鼠中表達和意義

李明軒 鄧麗佳 黨碩 李史恬 阿依木古麗·艾尼 聶永梅 李靜

(新疆醫(yī)科大學 1第一臨床醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830011；2基礎(chǔ)醫(yī)學院；3第二臨床醫(yī)學院；4西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院)

動脈粥樣硬化(AS)被稱為世界疾病中的頭號殺手，表現(xiàn)為AS斑塊的出現(xiàn)與發(fā)展。血管內(nèi)皮受到血流的低剪切應力從而導致?lián)p傷和修復的失衡是形成AS斑塊的原因〔1〕。脈管系統(tǒng)在層流低剪切應力作用下會使巨噬細胞和血小板在血管內(nèi)膜浸潤、泡沫細胞形成、斑塊產(chǎn)生等一系列AS標志性進程發(fā)生〔1〕。踝蛋白(Talin)作為一種結(jié)合并激活整合素的細胞骨架蛋白，通過連接肌動蛋白細胞骨架和膜整合素，將來自胞外的機械信號轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)的化學信號，這一過程稱為機械轉(zhuǎn)導〔2，3〕。Talin-1在血流剪切應力的誘導下發(fā)生機械解折疊會暴露新的識別位點，從而募集并結(jié)合參與機械轉(zhuǎn)導的細胞骨架蛋白，形成穩(wěn)定的黏附復合物，以此影響AS斑塊的病理進程〔4〕。本研究主要分析Talin-1與AS小鼠血清脂質(zhì)參數(shù)之間的相關(guān)性，探討Talin-1在AS發(fā)生發(fā)展中的作用及其作為AS早期診斷分子標志物的可能性。

1 材料與方法

1.1材料 Talin-1兔抗小鼠多克隆抗體(abcam，USA)，熒光素5-異硫氰酸酯(FITC)熒光素標記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗(AiMeijie Technology，武漢)，全自動生化分析儀(BK-360)；冰凍切片包埋劑(OCT，SAKURA，JPN)；冰凍切片機(Leica-1520)；熒光抗淬滅劑及細胞核染色劑(DAPI，Thermo Fisher，US)；小鼠Talin-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(MyBioSouce，USA)。

1.2動物模型的建立與取材 購自北京華阜康生物科技有限公司C57BL/6J ApoE-/-小鼠及C57BL/6J小鼠各8只，雄性，6周齡，體重(20±2)g，所有小鼠均于SPF環(huán)境飼養(yǎng)，溫度20℃～25℃，濕度50%～60%，每天光照12 h，使用含21%脂肪，34%蔗糖，0.15%膽固醇的西方飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠作為實驗組，對照組野生型小鼠給予正常飼料，飼養(yǎng)8 w以復制早期AS動物模型。

兩組小鼠定期稱重，于飼養(yǎng)8周末，將各組小鼠禁食12 h，腹腔注射苯巴比妥鈉麻醉后于眼窩靜脈叢取血約700 μl，靜置30 min，離心10 min(3 000 r/min)取血清，分別于-80℃?zhèn)溆谩９潭ㄐ∈螅仡i部中線做切口，用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液灌注心臟以沖凈血液，游離出主動脈根部至升胸主動脈部分的血管，4%多聚甲醛固定12 h后沉糖，OCT包埋，-80℃環(huán)境保存。

1.3血脂測定 全自動生化分析儀檢測脂質(zhì)參數(shù)總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.4病理組織形態(tài)檢測 將OCT包埋的組織于-20℃恒溫環(huán)境下，采取橫斷面連續(xù)切片的方法，行蘇木素-伊紅(HE)染色判斷AS發(fā)生發(fā)展的程度，光鏡下觀察并采圖。

1.5免疫熒光法 冰凍切片(6 μm)用4%的多聚甲醛固定15 min，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液避光封閉1 h；滴加足量兔抗鼠的Talin-1多克隆抗體(1∶200)，4℃孵育過夜；去除多余液體后添加FITC熒光素標記山羊抗兔IgG(1∶50)，室溫孵育2 h；滴加含DAPI的抗淬滅劑；熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。熒光強度半定量分析使用Image Pro Plus 6.0軟件完成。

1.6ELISA檢測可溶性Talin-1(sTalin-1)表達 按照小鼠Talin-1 ELISA試劑盒說明書，將樣品 OD值轉(zhuǎn)化為濃度(ng/ml)，并運用CurveExpert 1.3軟件繪制標準曲線(r=0.9997)，測定血清sTalin-1表達量。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行獨立樣本t檢驗、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1小鼠血脂檢測 實驗組TC、TG、LDL-C、HDL-C顯著高于對照組(P<0.01)，見表1。

表1 兩組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量對比

2.2病理學形態(tài)觀察 對照組血管管腔結(jié)構(gòu)清晰，具有明顯的內(nèi)膜、中膜和外膜結(jié)構(gòu)；血管內(nèi)皮完整，無炎性細胞浸潤，無脂質(zhì)聚積。實驗組則出現(xiàn)典型的血管壁增厚，部分內(nèi)膜破損，炎性細胞浸潤，彈性纖維破壞，內(nèi)膜表面有纖維組織的增生，部分血管腔出現(xiàn)AS斑塊，管腔狹窄，結(jié)合血脂四項參數(shù)分析，AS小鼠模型建立成功。見圖1。

圖1 主動脈弓和主動脈根部HE染色(×40)

2.3免疫熒光檢測病灶組織中Talin-1的表達 FITC標記的Talin-1為綠色熒光，DAPI染色的細胞核為藍色熒光，Talin-1在實驗組主動脈弓和主動脈根部內(nèi)膜和中膜呈陽性表達，對照組主動脈組織中Talin-1表達陽性的細胞浸潤較少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2、表2。

圖2 免疫熒光檢測Talin-1的表達(×100)

2.4各組血清中sTalin-1的表達 實驗組血清sTalin-1顯著高于對照組(P<0.05)。見表2。相關(guān)性分析顯示sTalin-1與TC(r=0.987，P<0.001)、TG(r=0.928，P=0.001)、LDL-C(r=0.984，P<0.001)呈正相關(guān)，且差異具有統(tǒng)計學意義，與HDL-C無顯著相關(guān)性(r=0.720，P=0.066)。

表2 Talin-1在主動脈弓和主動脈根部及血清中sTalin-1的表達

3 討 論

AS的發(fā)生是大多數(shù)心血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，臨床心血管疾病首先出現(xiàn)癥狀通常是在AS斑塊已經(jīng)成型并發(fā)展為中后期的階段，而從動脈壁發(fā)生異常到出現(xiàn)臨床癥狀一般需要經(jīng)過數(shù)十年甚至更長的亞臨床期，僅僅通過經(jīng)典的危險因素和評分量表(如Framingham風險評分)來估計AS和心血管事件的進展是不充分的，而疾病的分子標記物可以迅速、準確的篩查疾病的發(fā)生發(fā)展，具有重要臨床意義。

目前對于AS標志物的研究主要集中于早期及臨床前期的動脈壁改變標志物和循環(huán)標志物。對于動脈壁的形態(tài)改變可以通過高分辨率B超來測量內(nèi)膜中層厚度(IMT)，IMT的測量作為一種直觀并且可量化AS危險程度的方法成為早期AS的確診標準和對心血管風險評估的首選方法之一〔5〕，然而目前對于IMT的測量方法及如何在正常組織和病理組織之間設(shè)定精確的IMT閾值仍存在較大爭議。研究表明，超敏C-反應蛋白(hsCRP)可以誘導組織因子的表達、激活補體、介導單核細胞的遷移和巨噬細胞對LDL的攝取，整合總體細胞因子下游的信號通路，對血管疾病的進展有著直接作用，因此hsCRP被認為是最有希望的循環(huán)標志物〔6〕。然而，通過22項前瞻性研究的多元分析發(fā)現(xiàn)，在平衡其他危險因素后，hsCRP對風險預測的價值低于預期〔7〕。但有研究顯示，內(nèi)皮細胞加載低剪切應力將導致部分區(qū)域內(nèi)皮功能障礙〔1〕，并形成大量細胞因子、細胞外基質(zhì)蛋白組成的AS微環(huán)境〔8〕，雖然AS毫無疑問是由脂質(zhì)驅(qū)動的炎性病理過程，但在血脂水平正常的情況下，AS微環(huán)境也可以通過整合素來調(diào)節(jié)斑塊發(fā)生位置，并增加AS相關(guān)細胞在血流應力刺激下的敏感性〔9〕。

整合素已被證實作為重要的細胞膜表面機械信號感受器，在AS微環(huán)境中發(fā)揮重要作用〔10，11〕。事實上，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)AS斑塊和動脈外膜中整合素表達上調(diào)，并與IMT有著強相關(guān)性，提出將整合素作為AS的分子標志物〔12〕。由于整合素不具備激酶活性，故需要通過募集Talin-1等細胞骨架蛋白形成黏著斑來維持整合素與肌動蛋白絲的穩(wěn)定性，通過拉伸細胞外基質(zhì)和增強細胞內(nèi)肌動球蛋白收縮力，來增強肌動蛋白絲束，從而快速建立黏附位點結(jié)構(gòu)，增強AS相關(guān)細胞的遷移、黏附能力〔13〕。而Talin-1作為整合素從被激活到高親和力構(gòu)象改變這一過程的重要標志〔14〕，也是形成黏著斑的重要結(jié)構(gòu)蛋白，其大小為270 kD(包含2 541個氨基酸)〔15〕。Talin-1分子包含位于N端的兩個整合素結(jié)合位點和位于C端的三個肌動蛋白結(jié)合域(ABDs)，其N端頭部可以結(jié)合整合素亞單位近膜端，誘導整合素發(fā)生構(gòu)象變化并激活整合素〔16〕。C端也能與整合素β鏈、肌動蛋白、紐蛋白相結(jié)合，以此來為蛋白質(zhì)復合物的組裝提供支架〔17〕。Talin與整合素的連接以一種“橋梁”的作用機械耦聯(lián)細胞與周圍環(huán)境，將來自AS微環(huán)境的機械信號轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)化學信號，調(diào)控細胞的運動遷移等生物學行為。

Talin對整合素的激活至關(guān)重要。Talin基因的敲除可以導致整合素無法活化及啟動下游的級聯(lián)反應，中國倉鼠卵巢細胞模型是研究Talin與整合素作用機制中普遍被接受的模型，其中Talin可以與整合素的β3尾部結(jié)合并激活整合素從而促進卵巢細胞的增殖遷移〔18〕。Chinthalapudi等〔19〕使用Talin-1-/-卵巢細胞在共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)黏著斑的形成和整合素的激活都被抑制，而向細胞內(nèi)引入Talin-1基因則可以恢復整合素的活化，并使下游的生理反應正常進行〔20〕。Kopp等〔21〕發(fā)現(xiàn)，敲低Talin-1在內(nèi)皮細胞的黏附、遷移等生物學行為中起到負性調(diào)控的作用。由此推測，Talin-1作為一種細胞骨架蛋白與細胞的增殖、遷移、黏附、侵襲及AS的發(fā)生、發(fā)展等密切相關(guān)。基于Talin-1獨特的機械轉(zhuǎn)導特性賦予了癌細胞增殖、擴散的能力，sTalin-1與甲胎蛋白(AFP)等傳統(tǒng)標記物進行比較后發(fā)現(xiàn)，sTalin-1具有更高的特異性和敏感性，可以作為前列腺癌〔22〕、鼻咽癌〔23〕、肝癌〔24〕的新型生物標志物。

本實驗使用高脂飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠8 w的方法來構(gòu)建早期AS動物模型〔25〕，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。應用免疫熒光在組織學水平對Talin-1的含量進行定量和定位檢測，與對照組比較，實驗組Talin-1在血管病灶中表達上調(diào)，然而Von等〔26〕檢測了來自坦佩雷大學血管研究所(TVS)的動脈粥樣硬化樣本發(fā)現(xiàn)，Talin-1在粥樣斑塊中的表達低于健康血管，推測可能是由于TVS樣本均為AS晚期，與本實驗所用的AS早期模型不同，參與組成斑塊的細胞成分發(fā)生巨大改變，因此造成了早期AS血管病灶中Talin-1的表達較高，而晚期AS血管病灶中Talin-1表達降低的結(jié)果，但其中的具體機制仍需進一步分析。

本實驗ELISA檢測結(jié)果表明Talin-1可能與AS的發(fā)病機制有關(guān)，相關(guān)分析顯示sTalin-1與血脂參數(shù)的水平變化存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，這種相關(guān)性有可能在AS斑塊形成的病理過程中起到重要作用，通過測定sTalin-1對于判斷AS患者的病情有一定的臨床意義。

綜上，Talin-1表達上調(diào)可能是斑塊最初形成的觸發(fā)因素之一，引起這種上調(diào)的原因可能由外部因素引起，如剪切應力改變及血壓升高，導致參與組成AS微環(huán)境的細胞發(fā)生改變。另外，推測基因?qū)用嬉部赡軐е翧S斑塊中Talin-1上調(diào)。研究表明，機械傳感和機械轉(zhuǎn)導會影響DNA的包裝和蛋白質(zhì)組成的變化，基因突致使人群中AS的易感性升高〔27〕。sTalin-1參與組成機械信號感受器，可能在AS斑塊的形成和疾病的進展中起到關(guān)鍵作用，具有成為早期AS循環(huán)標志物的潛力，也為AS的早期確診奠定實驗基礎(chǔ)。