抗腫瘤壞死因子-α對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的干預(yù)作用

楊曉煒 劉鳳海 刁慧杰 石文秀 姚立巖

(牡丹江醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

缺血性腦卒中常伴不同程度的感覺、運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能等障礙，其致殘和致死性很高〔1，2〕。缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的重要病理過程。炎癥反應(yīng)是造成缺血再灌注損傷的重要機(jī)制〔3〕。腫瘤壞死因子(TNF)-α是近年新發(fā)現(xiàn)的具有多種生物學(xué)效應(yīng)的炎癥因子，參與缺血性腦卒中的炎癥免疫過程。TNF-α 是炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因子，在腦缺血再灌注早期，TNF-α合成和釋放增加是促進(jìn)缺血性腦卒中形成的重要原因〔4〕。因此，抗TNF-α等抗炎治療成為缺血性腦卒中治療的研究熱點(diǎn)。然而，抗炎治療在臨床實(shí)踐中卻常常達(dá)不到預(yù)期效果。如能探明 TNF-α 在腦缺血中損傷保護(hù)的平衡點(diǎn)及關(guān)鍵點(diǎn)，讓其在最適宜的時(shí)間發(fā)揮其最有利的作用對(duì)臨床缺血性腦卒中的治療將極為重要〔5〕。

抗TNF-α干預(yù)方法很多，益賽普〔注射用重組人Ⅱ型TNF受體-抗體融合蛋白(rhTNFR：Fc)〕是目前國(guó)內(nèi)使用最廣泛的一種 TNF-α 拮抗劑，益賽普是細(xì)胞表面 TNF-α 受體的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以抑制 TNF-α 生物活性，從而阻斷 TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)〔6〕。益賽普在臨床上已長(zhǎng)期應(yīng)用，其抗炎效果及安全性比較可靠。本研究在建立了大鼠局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO/R)〔7〕基礎(chǔ)上，以益賽普作為抗TNF-α的干預(yù)用藥，于大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)程嘗試用益賽普干預(yù)缺血再灌注后的腦損傷，并將各時(shí)點(diǎn)干預(yù)效果與常規(guī)用藥阿托伐他汀對(duì)比，論證最有效的干預(yù)時(shí)機(jī)及干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康老年雄性SD大鼠，224只，體重300～350 g。 溫度(25±1)℃，濕度50%±10%，自由覓食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2主要儀器和試劑

1.2.1主要儀器 -80℃冰箱(Haier 青島)、-20℃冰箱(Haier 青島)、4℃低速離心機(jī)(AXTDL5M-II 上海)、酶標(biāo)儀(Bio-Rad Laboratories 上海)、微量加樣器(Research plus 德國(guó))、分析天平(FA1204B 上海)、干燥箱(DZF 上海)。

1.2.2主要試劑 注射用重組人Ⅱ型TNF受體-抗體融合蛋白 (上海中信國(guó)健藥業(yè)有限公司)、阿托伐他?。杭兌却笥?9.19%(廣東陽江制藥廠有限公司)、大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、 TTC染色劑(Solarbio 北京索萊寶科技有限公司)、多聚甲醛、甲醛、磷酸鹽緩沖液(PBS)、生理鹽水。

1.3大鼠MCAO/R模型制作 大鼠禁食12 h且禁水6 h后，10%的水合氯醛(0.30 ml/100 g)腹腔注射麻醉，采用改良MCAO法，將直徑為0.26 mm的線栓預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸浸漬，60℃烘干處理，處理后置入大鼠右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈(CA)18～22 mm(根據(jù)動(dòng)物大小調(diào)整插入線栓的深度)，阻塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈，記錄梗阻開始時(shí)間，固定外端的線栓縫合皮膚并標(biāo)記留在皮膚外面線栓。大鼠未蘇醒時(shí)注意保暖。缺血2 h后，拔出線栓約10 mm，確保線栓退至頸總動(dòng)脈分杈處，實(shí)現(xiàn)腦缺血再灌注。模型成功的標(biāo)志：參照Longa等〔8〕的方法，對(duì)各組進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：0分，無神經(jīng)缺損癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，出現(xiàn)同側(cè)Horner征，行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，站立不穩(wěn)，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。評(píng)分在1～3分的大鼠認(rèn)為模型制作成功，納入實(shí)驗(yàn)分組。操作過程中出現(xiàn)迷走神經(jīng)損傷、線栓置入失敗或蛛網(wǎng)膜下隙出血、術(shù)后24 h 內(nèi)出現(xiàn)感染的大鼠為造模失敗。造模失敗按照隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊動(dòng)物并重新造模。

1.4動(dòng)物分組 隨機(jī)將大鼠分為6組：模型組16只，造模后3、6、12、24、48、72 h神經(jīng)評(píng)分；內(nèi)眥取血，測(cè)血清TNF-α；72 h取腦，其中8只測(cè)腦梗死體積比，另外8只測(cè)腦含水量。健康對(duì)照組16只，除不造模外其他操作同模型組。假手術(shù)組16只，除手術(shù)過程不插線外其他操作同模型組。預(yù)注射組16只，模型制備前0.5 h大鼠皮下注射益賽普0.6 mg/kg。TNF-α干預(yù)組80只，造模后將大鼠隨機(jī)分為5個(gè)亞組，每組16只。分別為造模后3、6、12、24、48 h組。每組于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)一次性經(jīng)皮下注射益賽普0.6 mg/kg進(jìn)行干預(yù)。他汀干預(yù)組80只，分組方式及指標(biāo)測(cè)定同TNF-α干預(yù)組。干預(yù)方式為經(jīng)腹腔注射阿托伐他汀20 mg/kg。

1.5神經(jīng)行為評(píng)分 腦缺血再灌注后3、6、12、24、48、72 h分別對(duì)各組進(jìn)行神經(jīng)功能損害評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Longa等〔8〕的方法，提起鼠尾離開地面33 cm左右，觀察兩前肢的伸展?fàn)顩r；大鼠置于地面，觀察其行走情況。分?jǐn)?shù)越高，說明其神經(jīng)行為損傷越重。

1.6梗死范圍的確定 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.30 ml/100 g)〔9〕，斷頭取腦。將腦組織標(biāo)本置于-20℃冰箱中20 min取出，切去額端1.0 mm，由前向后每隔2.0 mm作冠狀切片，共切5片。放置于1%TTC磷酸緩沖液(0.23 mol/L，pH7.5)中，37.5℃避光孵育，每隔15 min翻面一次，共孵育30 min。正常組織顯示出紅色，梗死組織顯示為白色。染色后數(shù)碼相機(jī)拍照，使用ImageJ圖像分析系統(tǒng)計(jì)算梗死體積。大鼠腦梗死體積百分比=(正常側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球的體積)/正常側(cè)大腦半球體積〔10〕。

1.7腦組織含水量測(cè)定 冰浴中斷頭，取右腦，除去小腦和低位腦干、嗅球，立即用分析天平稱其濕重。置160℃烤箱內(nèi)，24 h后稱干重，以計(jì)算含水量。公式如下：含水量=(濕重-干重)/濕重×100%〔11〕。

1.8血樣處理及炎癥因子的測(cè)定 動(dòng)物處死前各時(shí)點(diǎn)采用眼內(nèi)眥靜脈叢取血，每次取血1～2 ml，室溫靜置2 h左右，將血樣4℃3 000 r/min，離心10 min。分離出血清，置于-80℃冰箱保存。檢測(cè)時(shí)按試劑盒說明書采用ELISA檢測(cè)血清TNF-α。

1.9統(tǒng)計(jì)處理 應(yīng)用SPSS19.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，方差分析，單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，Dunnett-T檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1益賽普對(duì)腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用 大鼠腦缺血再灌注后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h間的TNF-α濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=44.876，P=0.000)，健康對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、預(yù)注射組的TNF-α濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=155.648，P=0.000)，健康對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、預(yù)注射組的TNF-α濃度隨時(shí)點(diǎn)變化規(guī)律不同(F=77.632，P=0.000)。模型組TNF-α造模后迅速升高，于腦缺血再灌注3 h開始顯著高于健康對(duì)照組及假手術(shù)組(P<0.01)，于24 h達(dá)到高峰，隨后開始下降，72 h仍高于假手術(shù)組及健康對(duì)照組(P<0.01)。預(yù)注射組與模型組比較，3、6、12、24 h TNF-α的含量顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 預(yù)注射對(duì)腦缺血再灌注損傷過程中不同時(shí)點(diǎn)TNF-α的影響

再灌注72 h，預(yù)注射組神經(jīng)功能評(píng)分顯著低于模型組(t=5.938，P<0.01)；腦含水量顯著低于模型組，顯著高于健康對(duì)照組(F=51.843，P<0.01)；梗死體積百分比顯著小于模型組(t=11.502，P<0.01)。見表2。

表2 預(yù)注射對(duì)腦缺血再灌注72 h后腦損傷的影響

2.2各時(shí)點(diǎn)干預(yù)對(duì)腦缺血再灌注后不同時(shí)點(diǎn)梗死體積百分比、腦含水量、神經(jīng)功能評(píng)分的影響 腦缺血再灌注3、6、12、24 h干預(yù)效果明顯，TNF-α干預(yù)組與他汀干預(yù)組都較模型組腦梗死體積明顯減小(P<0.05)，TNF-α干預(yù)組減小腦梗死體積的作用較他汀干預(yù)組更加明顯(P<0.05)。腦缺血再灌注48 h，他汀干預(yù)組與TNF-α干預(yù)組均不能減小梗死灶(P>0.05)。見表3及圖1。3、6、12、24 h TNF-α干預(yù)組與他汀干預(yù)組均較模型組顯著減少腦含水量(P<0.05)，TNF-α干預(yù)組效果更明顯(P<0.05)，48 h TNF-α干預(yù)組、他汀干預(yù)組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。24 h內(nèi) TNF-α干預(yù)組與他汀干預(yù)組均較模型組顯著減少神經(jīng)功能評(píng)分(P<0.05)，3 h、6 h TNF-α干預(yù)組效果顯著好于他汀干預(yù)組(P<0.05)，12、24 h兩干預(yù)組效果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，48 h TNF-α干預(yù)組、他汀干預(yù)組分別與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表5。可見，在腦缺血再灌注24 h內(nèi)TNF-α對(duì)腦損傷有促進(jìn)作用，超過24 h該作用將不再存在，抗TNF-α治療不再有效，因此，抗TNF-α治療越早越好，總體來看，對(duì)于減小梗死灶，減輕腦水腫及恢復(fù)神經(jīng)功能，TNF-α干預(yù)效果好于阿托伐他汀。

表3 各時(shí)點(diǎn)干預(yù)后腦缺血再灌注各時(shí)點(diǎn)梗死體積比較

圖1 各組腦梗死灶TTC染色

表4 各時(shí)點(diǎn)干預(yù)后腦缺血再灌注各時(shí)點(diǎn)腦含水量的比較

表5 各時(shí)點(diǎn)干預(yù)后腦缺血再灌注各時(shí)點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分的比較分)

3 討 論

近年來缺血性腦血管病的發(fā)病機(jī)制研究取得了很大進(jìn)展〔12〕。動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是缺血性腦卒中發(fā)病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，研究發(fā)現(xiàn)，AS是一個(gè)由脂質(zhì)與炎癥共同作用的慢性炎癥性疾病〔13〕，炎癥可通過一系列病理，生理變化促進(jìn)動(dòng)脈硬化、硬化斑塊破裂及在此基礎(chǔ)上的血小板聚集、血栓形成，最終導(dǎo)致動(dòng)脈阻塞。因而，腦缺血早期的炎癥反應(yīng)及其損傷作用日益受到關(guān)注，成為近年研究的熱點(diǎn)〔14〕。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種肽類激素，是機(jī)體抗感染反應(yīng)出現(xiàn)最早和最主要的炎癥因子之一〔15〕，可激活單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，增強(qiáng)其吞噬殺傷功能，促進(jìn)其釋放炎癥蛋白和炎性介質(zhì)，是機(jī)體免疫炎性反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子〔16〕。TNF-α作為致炎因子除誘發(fā)和促進(jìn)炎癥以外，還可通過細(xì)胞毒性、凝血等反應(yīng)及多種凋亡途徑加劇缺血后損傷〔14〕。本研究采用經(jīng)典的Longa 法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，即通過顱外置入線栓造成大腦中動(dòng)脈缺血，這是目前研究MCAO-R最常用模型。該模型的主要優(yōu)點(diǎn)是操作成功率高、可重復(fù)性好、并發(fā)癥少、一致性腦梗死效果確實(shí)，能夠更好地反映缺血性腦卒中的臨床特點(diǎn)及病理過程〔17〕。本研究結(jié)果提示TNF-α在缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

TNF-α對(duì)缺血性腦卒中發(fā)病的促進(jìn)作用不容忽視。TNF-α是缺血性腦卒中炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)物質(zhì)，是炎性組織中數(shù)量較大的早期介質(zhì)之一，可上調(diào)其他炎癥因子〔如白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8等〕的產(chǎn)生，同時(shí)激活招募單核-巨噬細(xì)胞，參與AS及缺血性腦損傷形成的全過程。TNF-α也能增加脂質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)如前列腺素和血小板激活因子，這些因子除影響血凝過程外，還可促成血管舒縮因子的下降和內(nèi)皮素(ET)的增加從而引發(fā)血管收縮，增加局部腦卒中的危險(xiǎn)性。因而，TNF-α早期的分泌合成與增加是腦梗死形成的主要原因〔18〕，此時(shí)下調(diào)炎性因子、阻止炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)，將對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用〔19〕。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了TNF-α在腦缺血再灌注形成中的作用。

急性腦梗死后腦組織局部過度的炎癥反應(yīng)是造成腦損傷的主要原因之一，因此，阻斷腦梗死后的炎癥反應(yīng)是改善梗死后腦損傷的重要手段〔20〕。然而，TNF-α對(duì)缺血性腦損傷的作用如何還存在爭(zhēng)議。國(guó)內(nèi)多數(shù)研究支持腦缺血后TNF-α的表達(dá)具有神經(jīng)毒性。TNF-α 可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞上的黏附分子的表達(dá)，加劇腦內(nèi)炎癥反應(yīng)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附作用，阻礙腦組織的供血，損傷局部血管，導(dǎo)致血管通透性增加，促使腦缺血和水腫的發(fā)生，加重缺血性腦組織的損傷〔21〕。陳紅芳等〔22〕報(bào)道腦梗死急性期血中TNF-α含量明顯升高，且與ET、一氧化氮(NO)均呈正相關(guān)，證實(shí)了升高的TNF-α不僅嚴(yán)重地破壞了NO-ET軸的正向調(diào)節(jié)作用導(dǎo)致其失衡狀態(tài)，而且促發(fā)和加重了腦梗死程度。TNF-α除了在炎性反應(yīng)啟動(dòng)和維持中的作用外，也具有終止炎癥的作用〔23〕。有研究認(rèn)為，腦缺血后2～7 d，TNF-α刺激成纖維細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)生長(zhǎng)因子，這有助于改善缺血狀態(tài)和神經(jīng)元生存。缺血后7～30 d，通過巨噬細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的絲氨酸激酶、微管蛋白-2激酶等，參與損傷組織吸收、修復(fù)和重塑〔24〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中恢復(fù)期TNF-α水平處于較高水平者預(yù)后良好，表明血清TNF-α水平的升高與發(fā)病后腦組織損傷的修復(fù)有關(guān)〔25〕，本研究發(fā)現(xiàn)，抗TNF-α干預(yù)在缺血性腦卒中發(fā)生24 h內(nèi)干預(yù)效果顯著，且干預(yù)越早，效果越好，而在缺血再灌注損傷恢復(fù)期尤其48 h 后再施加干預(yù)則無效。由此證實(shí)，缺血性腦卒中的不同時(shí)程TNF-α發(fā)揮不同作用。急性期表現(xiàn)為神經(jīng)毒性作用，而恢復(fù)期則可能表現(xiàn)為神經(jīng)修復(fù)作用，其修復(fù)作用尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。在腦損傷早期施加抗TNF-α干預(yù)，降低其促炎效應(yīng)，可能是今后治療腦缺血的一條新的有效途徑〔19〕。