LncRNA BLACAT1通過抑制miR-519d促進宮頸癌細胞的增殖、遷移與侵襲

郭改艷 舒麗莎

(1河北北方學院，河北 張家口 075000； 2河北北方學院附屬第一醫院婦產科)

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤中其發病率和死亡率僅次于乳腺癌〔1〕。盡管在臨床上采用先進的放射和化學療法技術，由于宮頸癌患者局部復發和遠處轉移，目前患者的預后仍然不理想〔2〕。近年來，長鏈非編碼RNA(LncRNAs)是一組長度超過200個核苷酸的RNA，缺乏蛋白質編碼能力，可以調節基因轉率、翻譯和翻譯后修飾〔3〕。LncRNAs參與許多細胞功能，包括增殖、分化、遷移、侵襲和凋亡〔4〕。LncRNAs在腫瘤發生和發展中的生物學作用已被廣泛研究，一些LncRNA可作為預測預后或有望成為惡性腫瘤診斷的生物標志物〔5,6〕。LncRNA BLACAT1在多種癌癥中異常表達，包括膀胱癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、結直腸癌和宮頸癌等〔7～9〕。有薈萃分析表明BLACAT1高表達可預測總生存期縮短、TNM晚期、腫瘤分極差及淋巴結轉移〔10〕。LncRNA BLACAT1在卵巢癌組織和細胞中過表達，敲降BLACAT1通過調節Wnt/β-catenin通路抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲〔11〕。LncRNA BLACAT1在宮頸癌的發生與發展的生物學作用尚未闡釋清楚。

miR-519d在宮頸癌組織和細胞中低表達。過表達miR-519d通過靶向HIF-2α抑制宮頸癌細胞增殖，促進細胞凋亡〔12〕。敲降miR-519d通過靶向Smad7促進宮頸癌的發生和轉移〔13〕。敲降BLACAT1通過調節miR-519d/Wnt/β-catenin通路抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲〔11〕。目前，關于BLACAT1通過調節miR-519d影響宮頸癌細胞生物學功能的研究尚未報道。本研究旨在探討BLACAT1在宮頸癌細胞中的表達和生物學功能的分子作用機制，為臨床宮頸癌早期診斷和治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1組織樣本 收集2018年1月至2019年10月12例來自河北北方學院附屬第一醫院婦產科的宮頸癌組織及配對的癌旁組織樣本，保存在液氮中。所有患者已確診為宮頸癌，且手術前未進行放化療等新輔助治療，患者家屬簽署本研究知情同意書，并經倫理委員會同意。

1.2細胞系、主要試劑與儀器 人正常宮頸上皮細胞(End1/E6E7)和人宮頸癌細胞系(C33a、Caski、SiHa和HeLa)均購于中科院上海細胞研究所。NC shRNA、LncRNA BLACAT1、NC、miR-519d mimics轉染試劑盒購于上海吉瑪生物公司。DMEM培養基和胎牛血清購于美國 Hyclone公司。Trizol試劑、SYBR Green Qpcr Super Mix、Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司。Transwell細胞板、基質膠為美國BD公司。CCK-8試劑盒購于武漢華美公司。雙熒光素酶報告基因試劑盒和報告基因載體購于Promega公司。抗體E-鈣黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、波形蛋白(Vimentin)購于美國CST。酶標儀、PCR儀、凝膠成像儀均于買美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3細胞培養與轉染 人正常宮頸上皮細胞(End1/E6E7)和人宮頸癌細胞系(C33a、Caski、SiHa和HeLa)添加含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，放入CO2、37℃恒溫培養箱中培養。待細胞生長到對數生長期時，傳代，接種6孔板，以備轉染實驗。

細胞轉染實驗Lipofectamine 2000慢病毒包裝質粒 NC shRNA、LncRNA BLACAT1、NC、miR-519d mimics分別轉染到HeLa細胞中。

1.4實時熒光定量PCR 收集宮頸癌組織及癌旁組織和細胞，用TRizol法提取總RNA。逆轉錄得到cDNA作為模板，SYBR Green Qpcr Super Mix 進行RT-PCR檢測。采用2-△△Ct法計算差異表達量。引物序列為BLACAT1-正義鏈： 5′-GCTGGAGTTTGTCCTGTCT-3′，BLACAT1-反義鏈： 5′-CTCATCGCCACCTGTTAT-3′；U6 snRNA-正義鏈:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 snRNA-反義鏈:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；hsa-miR-519d-正義鏈：5′-AAGTGCCTCCCTTTAGAGTGGT-3′，hsa-miR-519d-反義鏈： 5′-GGTGCA-GGGTCCGAGGTAT-3′。

1.5CCK-8檢測細胞增殖 將對數生長期的HeLa細胞接種于96孔板，每個實驗設計3個復孔。分組轉染后，在24、48、72 h加入10 μl CCK-8試劑，放回培養箱，2 h后拿出進行酶標儀檢測450 nm的吸光度(OD)值。

1.6Transwell檢測細胞遷移與侵襲 將轉染過的HeLa細胞，接種在Transwell小室的上室，細胞濃度為3×105個/ml，下室加10%胎牛血清的培養基，培養48 h取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，進行結晶紫染色，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，干燥，200倍倒置顯微鏡觀察。細胞侵襲能力在小室里加入基質膠。其他步驟與遷移實驗步驟相同。

1.7Western印跡檢測蛋白表達 細胞轉染后，用細胞蛋白提取試劑盒提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量。計算等量蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，然后將蛋白轉膜。加入5%脫脂牛奶封膜1 h，加入一抗放4℃冰箱過夜，一抗濃度E-cadherin(1 000∶1)、N-cadherin(800∶1)、Vimentin(1 500∶1)、GAPHD(500∶1)。洗膜，加入二抗，洗膜，加入化學發光劑進行顯影蛋白。采用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度。

1.8熒光素酶報告基因驗證LncRNA BLACAT1與miR-519d靶向關系 HeLa細胞轉染后處于對數生長期時接種于24孔板，培養24 h后，擴增LncRNA BLACAT1與miR-519d結合片段并導入到熒光素酶載體中構建野生型質粒。將其結合片段進行核苷酸突變，即為突變型質粒。參照Lipofectamine 2000操作說明進行轉染NC，miR-519d mimic，培養24 h后，收集細胞。根據雙熒光素酶試劑盒說明書進行染色，酶標儀檢測螢火蟲和海腎熒光活性值。

1.9統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1LncRNA BLACAT1在宮頸癌組織中的表達 與癌旁組織(1.02±0.09)相比，LncRNA BLACAT1在宮頸癌組織中的mRNA表達水平(6.13±0.27)升高，差異有統計學意義(t=62.20，P=0.000)。

2.2LncRNA BLACAT1在宮頸癌細胞系中高表達 與End1/E6E7細胞(1.00±0.06)相比，LncRNA BLACAT1在宮頸癌細胞系(C33a、SiHa、Caski和 HeLa)中mRNA表達水平(2.19±0.20、3.53±0.17、4.27±0.21、5.09±0.19)顯著升高(t=8.34、17.73、22.92、28.66，均P=0.000)，且HeLa細胞中LncRNA BLACAT1的mRNA表達水平最高。

2.3敲降LncRNA BLACAT1抑制宮頸癌細胞增殖 與NC shRNA組(1.03±0.05)相比，BLACAT1 shRNA組中LncRNA BLACAT1 mRNA表達水平(0.41±0.02)顯著降低(t=19.94，P=0.000)。與NC shRNA組相比，BLACAT1 shRNA組在24、48、72 h時細胞活力顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 敲降LncRNA BLACAT1對宮頸癌細胞活力的影響

2.4敲降LncRNA BLACAT1抑制宮頸癌細胞遷移與轉移 與NC shRNA組相比，BLACAT1 shRNA組中HeLa細胞遷移與侵襲細胞數目降低，差異有統計學意義(均P=0.000)。見圖1，表2。

表2 敲降LncRNA BLACAT1對宮頸癌細胞遷移與侵襲的影響個)

圖1 敲降LncRNA BLACAT1對宮頸癌細胞遷移與侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

2.5各組N-cadherin、Vimentin及E-cdaherin蛋白表達比較 與NC shRNA組相比，BLACAT1 shRNA組N-cadherin和Vimentin蛋白水平顯著減少，E-cadherin蛋白水平顯著增加(P<0.01)。見表3。

表3 敲降LncRNA BLACAT1后對宮頸癌細胞內E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達量的影響

2.6LncRNA BLACAT1靶向調節miR-519d 通過Stabase 2在線分析軟件預測miR-519d可能是LncRNA BLACAT1的靶基因。野生型組(WT)中，過表達miR-519d 熒光素酶活性(0.45±0.02)顯著低于NC組(0.98±0.03)，差異有統計學意義(t=25.46，P=0.001)。與NC shRNA組(0.49±0.11)相比，BLACAT1 shRNA組中miR-519d表達水平(0.98±0.12)顯著增加，差異有統計學意義(t=5.214,P=0.003)。

3 討 論

迄今為止，在宮頸癌的預防、診斷和治療方面取得了相當大的進展〔14〕。但由于宮頸癌的轉移和復發，傳統手術、放射治療和化療對患者的治療仍然有限〔15〕。如果宮頸癌患者可得到早期診斷和早期治療，5年生存率可高達90%〔16〕。然而，宮頸癌的早期癥狀并不明顯。70%的宮頸癌患者都是女性，中晚期約占總發病率的31%，宮頸癌經治療后會復發，且預后極差〔17,18〕。因此，尋找有效的治療靶點和預后標志物是宮頸癌診斷和治療的迫切需要

LncRNAs是一種新的基因表達調控因子，在各種疾病病理生理過程中起關鍵作用。近年來，LncRNAs已成為多種人類惡性腫瘤的研究熱點〔19〕。先前研究表明LncRNA BLACAT1在多種腫瘤中過度表達，如乳腺癌〔20〕、頭頸鱗癌〔21〕和骨肉瘤癌〔22〕。然而，BLACAT1在宮頸癌中的作用尚不清楚。目前發現BLACAT1在宮頸癌組織和細胞中的表達異常增加。LncRNAs在細胞增殖、遷移和侵襲中的作用已被廣泛報道〔23,24〕。據報道在小鼠體內，BLACAT1基因敲除降低了胃癌腫瘤的生長〔25〕。研究報道BLACAT1基因敲除可抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔26〕。本文結果表明，敲降BLACAT抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲，表明BLACAT1在癌癥進展中起抑癌基因的作用。

LncRNAs可能作為miRNAs發揮作用“海綿”來減弱不同miRNAs的水平。例如：LncRNA LIPE-As1在宮頸癌組織中過表達，可以預測宮頸癌的生存率低，通過調節miR-195-5p/MAPK促進癌細胞增殖與轉移〔27〕。有研究報道過表達miR-519d通過靶向HIF-2α抑制宮頸癌細胞增殖，促進細胞凋亡〔12〕。敲降miR-519d通過靶向Smad7促進宮頸癌的發生和轉移〔13〕。因此，敲降BLACAT1可能通過調節miR-519d抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上，BLACAT1在宮頸癌組織和細胞中表達上調，通過靶向負調節miR-519d參與宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲功能。本研究為BLACAT1在宮頸癌中生物學功能提供了理論基礎，為宮頸癌早期診斷和治療提供科學依據。