長鏈非編碼RNA LINC00943對結核分枝桿菌感染小鼠肺泡巨噬細胞遷移能力的影響及機制

朱杰華 杜文勝 陳莉 陳光紅 羅軍敏

(遵義醫科大學 1附屬醫院醫學檢驗科，貴州 遵義 563000；2檢驗醫學院；3基礎醫學院免疫學教研室)

肺結核(TB)是一種由結核分枝桿菌侵及肺部而引起的慢性傳染病，在我國患病率較高，近年來由于耐藥菌株數量的不斷增加，給TB治療帶來新的挑戰〔1〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的RNA分子，可參與細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程〔2〕。有研究發現LINC00943參與多種腫瘤發生發展，可能成為潛在的治療靶點〔3〕。然而，LINC00943在TB中的作用機制尚未明確。微小RNA(miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，可通過靶向作用于靶基因的3′-UTR，在轉錄后水平調控基因表達，且可調控細胞增殖、細胞凋亡等生物學過程〔4〕。既往研究表明，miRNA在宿主-致病原作用網絡中發揮作用，可調節感染后細胞免疫反應及限制細菌增殖〔5〕。已有研究發現miR-125b-5p在TB患者和結核分枝桿菌感染的細胞中高表達，參與TB的發生發展〔6〕。本研究通過使用結核分枝桿菌感染小鼠肺泡巨噬細胞構建TB體外細胞模型，旨在探討LINC00943對TB體外細胞模型細胞遷移能力的影響，為TB治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑 小鼠巨噬細胞(MH-S細胞系)和結核分枝桿菌(H37Ra菌株)均購自美國ATCC；胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素及RPMI1640培養基均購自美國Gibco公司；LINC00943的野生型(LINC00943-WT)和突變型(LINC00943-MUT)熒光素酶報告載體均由北京易科潘搏生物科技有限公司構建；pmirGLO熒光素酶報告系統質粒購自上海海吉浩格生物科技有限公司；LINC00943小干擾RNA(si-LINC00943)及陰性對照小干擾RNA(si-NC)由吉瑪生物科技有限公司合成；miR-125b-5p模擬物(miR-125b-5p mi)及陰性對照寡核苷酸(miR-NC)均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因載體(pmirGLO載體)和逆轉錄試劑盒均購自美國Promega公司；miScfipt SYBR Green PCR Kit miRNA定量擴增反應體系，購自德國Qiagen公司；一抗熱休克蛋白(HSP)65(ab92416)，二抗山羊抗鼠IgG H&L(FITC)(ab6785)均購自英國Abcam公司；ProFlex PCR 系統購自美國ThermoFisher公司；FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2細胞培養 將小鼠巨噬細胞MH-S置于含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中，在37℃，5% CO2培養箱中培養。

1.3模型構建及轉染前分組 將MH-S細胞隨機分為對照組和模型組，對照組常規培養；模型組細胞使用感染復數為10的H37Ra菌株感染，在感染后4 h用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞3次，并加入新鮮的完全培養基中。

1.4細胞轉染及轉染后分組 使用LipofectamineTM2000轉染試劑并根據操作說明將si-NC、si-LINC00943、miR-NC miR-125b-5p mi轉染至MH-S細胞，并依次設為si-NC組、si-LINC00943組、miR-NC組、miR-125b-5p mi組，其中miR-NC組、miR-125b-5p mi組僅用于雙熒光素酶實驗。

1.5激光共聚焦顯微鏡下觀察MH-S細胞感染細菌情況 細胞感染方法同1.3。感染H37Ra后，加入4%多聚甲醛固定細胞 15 min，滴加山羊血清封閉液室溫封閉20 min，加入一抗(稀釋度1∶1 500)4℃過夜，而后加入綠色熒光標記的二抗(稀釋度1∶500)室溫孵育2 h，封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，使用 Image J軟件分析細菌熒光強度。

1.6劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力 將細胞接種于6孔板，當細胞生長達到100%融合度時，用10 μl無菌槍頭在6孔板中央劃痕，用PBS沖洗細胞殘渣2～3次，在無血清培養基，37℃，5% CO2條件下繼續培養，分別于0、24 h在顯微鏡下觀察細胞劃痕愈合情況。細胞遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。每組細胞做3個平行孔，實驗重復3次。

1.7雙熒光素酶實驗驗證LINC00943與miR-125b-5p的結合關系 采用生物信息軟件starbase在線預測LINC00943的靶基因，結果發現LINC00943和miR-125b-5p含有互補結合位點，隨后對二者的靶向關系進行驗證。分別將含有LINC00943-WT和LINC00943-MUT的熒光素酶報告基因載體轉染進MH-S細胞中，隨后將miR-125b-5p mi或miR-NC共轉染至MH-S細胞。轉染后48 h，收集各組細胞檢測熒光素酶活性。

1.8實時熒光定量PCR檢測miR-125b-5p的表達量 取MH-S細胞，按照說明書要求采用TRIzol試劑提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。使用miScfipt SYBR Green PCR Kit miRNA定量擴增反應體系進行實時熒光定量PCR反應。實時PCR條件為：95℃預變性8 min，隨后以93℃ 15 s、 55℃ 30 s和72℃ 30 s進行40個循環，使用2-ΔΔCt方法計算miR-125b-5p的相對表達量。

1.9統計學分析 采用SPSS25.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1敲低LINC00943對MH-S細胞內細菌熒光強度和細胞感染比例的影響 與對照組相比，模型組細胞內細菌熒光強度及細胞感染比例顯著增加(P<0.01)；與si-NC組相比，si-LINC00943組細胞內的細菌熒光強度及細胞感染比例顯著降低(P<0.05，P<0.001)，說明MH-S細胞感染H37Ra菌株的模型建立成功。見圖1和表1。

表1 各組細菌熒光強度比較

2.2敲低LINC00943對MH-S細胞遷移能力的影響 與對照組〔(23.54±2.67)%〕相比，模型組細胞遷移率〔(64.15±2.32)%〕顯著提高(P<0.001)；與si-NC組〔(62.77±1.64)%〕相比，si-LINC00943組細胞遷移率〔(43.56±4.75)%〕顯著降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 劃痕愈合實驗檢測細胞的遷移(×100)

2.3雙熒光素酶實驗驗證LINC00943與miR-125b-5p的結合關系 starbase數據庫預測LINC00943與miR-125b-5p存在互補結合位點，見圖3。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，與miR-NC組相比，miR-125b-5p mi組中含LINC00943-WT熒光素酶報告質粒的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，而miR-125b-5p mi組中含LINC00943-WT熒光素酶報告質粒的熒光素酶活性無差異(P>0.05)，見表2。

表2 各組熒光素酶活性比較

圖3 LINC00943含有與miR-125b-5p互補的結合位點

2.4LINC00943對miR-125b-5p表達水平的影響 qRT-PCR實驗結果顯示，si-LINC00943組中miR-125b-5p的表達水平(1.56±0.09)較si-NC組(0.98±0.11)顯著增加(P<0.01)。

3 討 論

結核分枝桿菌是一種胞內寄生菌，而肺泡巨噬細胞是其主要的宿主和靶細胞〔7〕。近年來LncRNA的生物功能被探索與研究，發現其功能和基因表達與多種疾病的發生發展密切相關〔8〕。如在帕金森病中，敲低LINC00943可提高MPP+誘導SK-N-SH細胞的細胞活力及抑制細胞凋亡，并通過miR-15b-5p/RAB3IP軸減輕炎癥性和氧化性神經元損傷〔9〕；其他研究報道也發現，敲低LINC00943可通過調節miR-7-5p/CXCL1212軸減輕MPP+誘導的神經元損傷，LINC00943可作為帕金森病的治療靶點〔10〕。另外，LINC00943在胃癌中高表達，并與胃癌患者的不良預后相關，敲低LINC00943可抑制胃癌細胞增殖，通過靶向miR-101-3p調節胃癌細胞增殖和化學敏感性〔11〕。本研究結果說明敲低LINC00943對MH-S細胞的染菌能力及遷移能力均有抑制作用。

LncRNA可作為miRNA的“分子海綿”而降低miRNA豐度，并與miRNA競爭性結合〔12,13〕。miR-125b-5p是一類miRNA，研究表明其可作為抑癌基因參與多種疾病的發生發展〔14〕。既往研究表明miR-125b-5p在結核分枝桿菌BCG感染的RAW264.7巨噬細胞中顯著上調，并通過靶向DRAM2抑制細胞自噬〔15〕。本研究發現LINC00943可與miR-125b-5p靶向結合，且敲低LINC00943可顯著促進miR-125b-5p的表達。