冠心病患者與健康人群外周血中內皮祖細胞微小RNA表達

劉一炫 趙雅紅 謝富蘭 蒙榮森 靳文

(廣東省第二人民醫院心內三科，廣東 廣州 510300)

微小RNAs(miRNA)是在真核生物中存在且保守進化的非編碼內源性RNA單鏈小分子，在轉錄后調控中發揮作用。miRNA與冠心病心肌細胞缺氧缺血狀態、血管壁細胞受損、脂質代謝變化等病理機制密切相關〔1〕。在急性心肌梗死中，miRNA-21可促進血管受損后新生內膜增生，對冠心病評估預后、診斷具有重要的臨床價值。外周血內皮祖細胞在動脈粥樣硬化的防治中具有重要作用，內皮細胞功能由多種miRNA進行調控，促進血管內皮化和新生。有研究〔2〕指出，冠心病患者外周血中內皮祖細胞的數目較少，生成血管能力、遷移、黏附、增殖能力損傷。本研究探討健康人群和冠心病病人外周血中內皮祖細胞miRNA的表達水平。

1 資料和方法

1.1一般資料 選擇2016年6月至2017年3月廣東省第二人民醫院收治的冠心病患者60例為冠心病組，男37例，女23例，年齡42～77歲，平均(53.8±3.6)歲；體重指數(BMI)18～25 kg/m2，平均(23.7±1.8)kg/m2；病情嚴重程度：急性心肌梗死32例，心絞痛28例；病程2～7年，平均(4.5±2.1)年。納入標準：符合世界衛生組織制定的冠心病診斷標準〔3〕；經冠狀動脈造影、臨床特征確診。同期選擇體檢健康者60例為對照組，其中男36例，女24例，年齡42～77歲，平均(53.7±3.6)歲；BMI 18～25 kg/m2，平均(23.8±1.8)kg/m2。兩組年齡、性別、BMI等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。研究對象均自愿參加本研究，并簽署知情同意書。排除標準：排除對外周血內皮祖細胞的功能和數目產生影響的病變、血液系統病變、腫瘤、心肌病、梅毒、肝炎、哺乳期和妊娠女性、精神異常無法配合者，臨床資料缺失者。

1.2儀器和試劑 湖北醫藥學院基礎醫學研究所提供二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、多聚甲醛、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)，麒麟醫用儀器廠生產的Boyden 小室，Corning公司生產的96孔、24孔培養板，Thermo公司生產的酶標儀，Zeiss公司生產的激光掃描共聚焦熒光顯微鏡，Olympus生產的倒置相差顯微鏡，Binder公司生產的37℃恒溫細胞培養箱，阿爾泰公司生產的超凈工作臺，Eppendorf公司生產的水平低速離心機，山東奧塞特醫療器械有限公司生產的5 ml肝素無菌抗凝管，Molecular Probe公司生產的Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白，Lonza公司生產的內皮細胞生長培養基(EGM)-2培養基，Millipore 公司生產的人纖維連接蛋白，Sigma公司生產的FITC標記的荊豆凝集素I、人淋巴細胞分離液。7500熒光定量RCR儀，無RNA酶純水，無水乙醇，外源性cel-miR-39，熒光探針，實時熒光定量(qRT)-PCR試劑盒，RNA反轉錄試劑盒、總RNA提取試劑盒。miRNA-21序列為UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。

1.3方法

1.3.1鑒定、培養、分離內皮祖細胞 采集10 ml肘靜脈血，密度梯度離心法收集外周血單個核細胞24孔細胞培養板包被人纖維連接蛋白，接種單個核細胞，EGM-2培養基培養4 d，非貼壁細胞予以PBS除去，培養液更換至1 w，予以Dil-acLDL及FITC-UEA-I標記細胞后，采用激光共聚焦顯微鏡鑒定，正在分化的內皮祖細胞為Dil-acLDL及FITC-UEA-I標記染色雙陽性細胞。隨機選擇15個內皮祖細胞，在200倍視野下取平均值。

1.3.2遷移能力實驗 收集貼壁細胞并消化，Boyden小室的下室加入50 μg/L血管內皮生長因子和200 μl培養液。相同數量的內皮祖細胞注入上室，在5%二氧化碳溫箱內、37℃培養24 h；將濾膜上的未移動細胞刮去，予以甲醇3～5 min固定，DAPI染色10 min，沖洗蒸餾水，晾干后200倍顯微鏡下觀察向底層遷移的細胞。

1.3.3增殖能力實驗 收集貼壁細胞并消化，96孔細胞培養板包被人纖維連接蛋白，接種內皮祖細胞，每個標本設置空白對照3個復孔，二氧化碳培養箱內轉移培養板，在飽和濕度、5%二氧化碳、37℃培養24 h，將20 μl MTT液體加入每孔內，培養4 h，除去上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，震蕩器10 min充分震蕩，在490 nm波長的酶標儀下檢測吸光度。

1.3.4黏附能力實驗 收集貼壁細胞并消化，96孔細胞培養板包被人纖維連接蛋白，接種相同數目的內皮祖細胞，在5%二氧化碳、37℃培養30 min，隨機選擇9個貼壁細胞，200倍熒光顯微鏡下計數。全部研究對象在空腹下采集2 ml外周靜脈血，在4℃乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中放置，3 000 r/min離心10 min，-80℃保存上清液。行qRT-PCR檢測外周血中內皮祖細胞miRNA-21、miRNA-150的表達水平。根據試劑說明書提取樣品總RNA，反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環，取3次的平均值。

1.4觀察指標 比較冠心病組、對照組的血清肌酸激酶(CK)、血清CK同工酶(CK-MB)、血清肌鈣蛋白(cTn)I水平。

1.5統計學分析 采用SPSS22.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組外周血內皮祖細胞增殖、遷移、黏附能力比較 冠心病組外周血內皮祖細胞數目、遷移能力、增殖能力、黏附能力與對照組相比顯著下降(均P<0.01)，見表1，圖1。

圖1 兩組激光共聚焦顯微鏡檢查Dil-acLDL及FITC-UEA-I染色雙陽性(×200)

表1 兩組外周血內皮祖細胞數目、增殖、遷移、黏附能力比較個)

2.2兩組外周血內皮祖細胞miRNA表達水平比較 冠心病組外周血中內皮祖細胞miRNA-21、mi-RNA-150表達水平顯著高于對照組(P<0.01)，見表2。

表2 兩組外周血內皮祖細胞miRNA表達水平比較

2.3兩組血清CK、CK-MB、cTnI水平比較 冠心病組的血清CK、CK-MB、cTnI水平與對照組比較顯著降低(P<0.01)，見表3。

表3 兩組CK、CK-MB、cTnI水平比較

3 討 論

心肌細胞凋亡的直接因素之一為心肌缺血，大量研究發現miRNA-21在心肌缺血再灌注損傷和心肌細胞凋亡中發揮著重要的作用〔4，5〕。預處理或熱休克可誘導miRNA-21表達，促使心肌梗死面積顯著下降，說明miRNAs介導的心肌細胞保護機制中起到主要作用的是內皮誘導型一氧化氮合成酶、熱休克蛋白70〔6，7〕。有研究〔8〕檢測心肌梗死患者心肌組織標本的miRNAs表達水平，發現心肌梗死部位的內部區域miRNA-21表達水平下降，而邊緣區miRNA-21顯著升高。在健康人中，心臟miRNA-21呈現低水平表達，但在心臟缺氧缺血、心肌肥厚、心衰患者中miRNA水平顯著上升〔9〕。研究發現，miRNA可對L-型鈣通道蛋白表達水平進行負性調節，細胞內的Ca2+濃度顯著下降，對心肌細胞肥大產生抑制作用。冠心病的開始環節為破壞了內皮系統，維持內皮的完整性可避免惡性心血管事件的發生，激活炎性反應下段通路〔10，11〕。

本研究結果與葉小林等〔12〕的結果大體一致，miRNA配對靶基因的進程主要為：(1)對靶基因翻譯編碼蛋白質的抑制產生抑制或降解作用；(2)對靶基因的半衰期進行改變；(3)進入細胞核，在轉錄水平對靶基因的表達進行沉默調控。miRNA可調控代謝酶、腳手架蛋白、信號蛋白、轉錄因子等靶基因，在調控代謝網、蛋白質相互作用網、轉導細胞信號網、調控基因網等生物分子網絡中起到關鍵作用。同時修復血管內皮，血管內皮受損后可經由內皮祖細胞進行再生分化，促使受損血管快速形成血管再內皮化，抑制冠心病的病理進程。修復受損內皮的內皮祖細胞過程是一個較為復雜的歸巢過程，在基質細胞源性因子、成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子等各種生長因子的作用下，內皮祖細胞由骨髓中向外周血中動員，并向內皮的受損部位進行遷移、黏附，在局部發生分化、存活、增殖，經由旁分泌、融合、整合等方式在修復血管內皮中發揮重要作用〔13,14〕。

綜上，冠心病患者外周血中內皮祖細胞的數目較少，生成血管能力、遷移、黏附、增殖能力損傷，表達多種miRNA水平差異顯著。