基于PI3K/Akt通路探究右美托咪定對麻醉所致大鼠海馬區細胞凋亡的影響

朱晶 張春霞 余喻

(1九江市第五人民醫院麻醉科，江西 九江 332000；2九江市中醫醫院麻醉科)

舒芬太尼是臨床上常用的麻醉藥物之一，有起效快、蘇醒迅速的特點，在臨床廣泛應用于全身麻醉的誘導和維持〔1,2〕。但臨床研究顯示，舒芬太尼的使用有神經毒性，能夠促進神經元凋亡，降低樹突棘的密度，嚴重者會導致遠期認知功能障礙〔3〕。右美托咪定是臨床常用的高選擇性受體激動藥，能夠減輕臨床麻醉所帶來的對大腦損傷情況〔4,5〕。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路廣泛存在于各種神經細胞中，是膜受體細胞信號向細胞內轉導的重要途徑〔6,7〕。本研究旨在探究基于PI3K/Akt通路分析右美托咪定對麻醉所致大鼠海馬區細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取SD大鼠(哈爾濱維科生物技術有限公司，許可證號：XYXK(黑)2020-001)30只，年齡3～6 w，平均(4.6±1.1)w，體重198～216 g，平均(207.3±6.9)g，所有大鼠在相對濕度40%～45%、光照12 h、溫度(23.8±1.5)℃環境中喂養1 w。隨后隨機分為對照組、舒芬太尼組、舒芬太尼+右美托咪定組各10只。本研究遵循動物實驗3-R原則，且通過醫院動物倫理委員會認可。實驗藥物、試劑、儀器：流式細胞儀(美國Beckman公司)；舒芬太尼(宜昌人福藥業有限責任公司)；右美托咪定(天津西瑪科技有限公司)；Bax、Bcl-2、caspase3抗體(Santa Cruze Biotechnology 公司)。

1.2藥物干預 舒芬太尼組給予大鼠舒芬太尼10 μg/L進行腹腔注射，舒芬太尼+右美托咪定組在舒芬太尼組的基礎上給予大鼠腹腔注射50 μg/kg，對照組給予大鼠等量生理鹽水腹腔注射。所有大鼠給藥14 d。

1.3神經功能檢測 各組大鼠干預24 h后進行Y-迷宮實驗：在Y-迷宮之后控制儀釋放電擊，電壓設置為70 V，延遲2 s對大鼠進行足部電擊，控制儀中的反射箱內安置3個信號燈，按照燈光信號對大鼠進行電擊，讓大鼠逃離到安全區域。記錄各組大鼠Longa評分法，評分共分為5級，分數越高證明大鼠神經功能缺損越嚴重。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色 所有大鼠干預后斷頭處死，提取大鼠海馬組織，將提取的組織放置在15%甲醇進行固定后常規石蠟包埋，3 μm下連續切片，進行HE染色。

1.5細胞凋亡檢測 使用流式細胞儀對大鼠細胞凋亡率進行檢測：將各組細胞轉染質粒24 h后，使用0.25胰酶消化5 min后至細胞瓶呈霧狀之后，磷酸鹽緩沖液(PBS)吹打下來，4℃、2 000 r/min離心3 min，PBS洗滌、離心、重懸2次，之后使用流式細胞儀對細胞凋亡率進行分析。

1.6Bcl-2、Bax、caspase3、PI3K、Akt表達量檢測 使用Western印跡法檢測Bcl-2、Bax、caspase3、PI3K、Akt表達量：對標本以PBS沖洗后，行30 min裂解，后對蛋白濃度進行測定。選擇20 μg/孔蛋白質，添加完成蛋白緩沖液后進行10 min電泳，后將電轉膜浸泡在10%牛奶中，在常溫環境下進行90 min封存。后結合一抗、稀釋，進行1 d孵育，取出以TBST液沖洗，后結合二抗，保存60 min后開始清洗與顯色，對Bcl-2、Bax、caspase3、PI3K、Akt表達進行檢測。

1.7統計學處理 使用SPSS20.0軟件進行Kolmogorov-Smirnov檢驗、方差齊性檢驗、t檢驗及F檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠學習記憶能力比較 舒芬太尼組Y迷宮實驗中Longa評分、逃離時間、錯誤反應次數顯著高于對照組、舒芬太尼+右美托咪定組(P<0.05)，舒芬太尼+右美托咪定組顯著高于對照組(P<0.05)，見表1。

2.2各組不同時間點海馬區細胞凋亡率比較 舒芬太尼組各時間點海馬區細胞凋亡率顯著高于對照組、舒芬太尼+右美托咪定組(P<0.05)；舒芬太尼+右美托咪定組顯著高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 各組學習記憶能力及不同時間點海馬區細胞凋亡率比較

2.3海馬區組織HE染色圖 對照組大鼠海馬神經元的形態結構基本正常，核仁完整，細胞器結構較為清晰。舒芬太尼組大鼠海馬神經元出現細胞核明顯腫脹，染色質密度降低，線粒體空泡化等細胞結構出現損傷。舒芬太尼+右美托咪定組大鼠海馬區神經元細胞結構損傷減輕，表現為細胞核腫脹現象減少，染色質密度逐漸整改，線粒體結構趨于正常。見圖1。

圖1 海馬區組織HE染色(×400)

2.4各組Bcl-2、Bax、caspase3表達比較 舒芬太尼組Bcl-2表達顯著低于對照組、舒芬太尼+右美托咪定組，Bax、caspase3表達顯著高于對照組、舒芬太尼+右美托咪定組(P<0.05)；舒芬太尼+右美托咪定組Bcl-2表達顯著低于對照組，Bax、caspase3表達顯著高于對照組(P<0.05)，見表2，圖2。

2.5各組PI3K、Akt表達量對比 舒芬太尼組PI3K、Akt表達顯著高于對照組、舒芬太尼+右美托咪定組(P<0.05)，舒芬太尼+右美托咪定組顯著高于對照組(P<0.05)，見表2，圖3。

表2 各組Bcl-2、Bax、caspase3相對表達量及PI3K、Akt表達量比較

1～3:對照組，舒芬太尼組，舒芬太尼+右美托咪定組；同圖3圖2 Western印跡檢測Bcl-2、Bax、caspase3相對表達量

圖3 Western印跡檢測PI3K、Akt表達量

3 討 論

麻醉是由藥物或其他方式造成中樞神經或周圍神經系統的可逆性功能抑制，這種抑制的特點主要是感覺、痛覺的喪失〔8,9〕。麻醉作為臨床手術時常用的干預方式，在起到較好干預效果的同時會對患者長時期的行為改變，患者學習、記憶等功能出現異常，提示麻醉可能損傷中樞神經〔10〕。

右美托咪定作為一種有效的α2-腎上腺素受體激動劑，其是美托咪定的右旋異構體，通過激動腦及脊髓的α2受體產生鎮痛、鎮靜及抗交感作用。臨床研究顯示，右美托咪定對多種腦損傷模型進行干預，對神經保護有較好的作用〔11,12〕。本研究結果說明右美托咪定能夠使大鼠神經功能及記憶功能得到有效改善。

大腦神經海馬細胞的凋亡是引起大鼠神經功能受損的重要因素之一，細胞凋亡的過程受到各種基因調控。caspase家族及Bcl-2家族關于海馬神經細胞凋亡的研究較多〔13,14〕。其中caspase3、caspase9是臨床最常見的caspase凋亡因子，caspase3主要是通過caspase9自身裂解后獲得活性，從而引起細胞凋亡的級聯反應，最終導致細胞凋亡。Bcl-2家族中的Bcl-2蛋白、Bax蛋白在臨床也能夠調控細胞凋亡，Bcl-2屬于一種常見的抑癌蛋白，Bax屬于一種凋亡誘導基因，兩者結合以二聚體的形式存在，在細胞增殖和凋亡過程中發揮重要作用〔15,16〕。趙允起等〔17〕在臨床研究中指出，使用七氟烷吸入麻醉能夠降低大鼠海馬區Bcl-2蛋白。本研究發現，使用右美托咪定對麻醉后大鼠進行干預能夠降低大鼠海馬區細胞凋亡率，有一定的干預效果。

有研究顯示，臨床中有多種信號通路能夠作用于細胞的增殖、凋亡。其中PI3K/Akt信號通路是臨床最為常見的一種，當PI3K/Akt通路異常活化能夠促進細胞的生存及細胞分裂〔18,19〕。PI3K/Akt通路作為酶聯受體介導的重要信號轉導通路，參與了生長因子、細胞因子等信號傳導的同時，還在細胞增殖、分化及凋亡中有重要角色，表現出了多種生物學功能。PI3K是由p110及p85亞單位所組成的異源二聚體，當PI3K磷酸化后導致Akt蛋白結構發生改變且轉移到細胞膜，活化的Akt能夠激活下游靶基因mTOR參與細胞的增殖、凋亡〔20〕。夏洪蓮等〔21〕研究發現，使用異丙酚對缺血再灌注大鼠進行干預，能夠通過PI3K/Akt通路抑制大鼠細胞凋亡率。本研究結果說明使用右美托咪定能夠抑制PI3K/Akt通路，從而抑制麻醉導致大鼠海馬區細胞凋亡，有較好的干預效果。

綜上，使用右美托咪定對麻醉后大鼠進行干預，能夠抑制PI3K/Akt通路，調節Bcl-2、Bax、caspase3表達，起到對麻醉所致大鼠海馬區細胞凋亡的抑制，具有較好的干預效果。