過表達LINC00595降低前列腺癌細胞PC3對多西他賽的耐藥性

邢增術 李賽蓮 禹剛 邢健生 王國任 劉振湘

(中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院 1泌尿外科，海南 海口 570208；2消化內科)

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤〔1，2〕。目前，晚期轉移性前列腺癌患者的一線治療仍是內分泌治療〔3，4〕。患者一旦進入去勢抵抗前列腺癌期，其預后一般較差。自2004年美國FDA批準多西他賽(DTX)治療去勢抵抗前列腺癌期以來，已被證明能有效延長去勢抵抗前列腺癌期患者的總生存時間，但大多數患者最終對化療產生耐藥性〔5〕。因此，研究去勢抵抗前列腺癌對DTX耐藥的分子機制對于探索新的診斷生物標志物和新型有效的治療策略十分必要。長鏈非編碼RNA(LncRNAs)是一種大于200個核苷酸的非編碼RNA，在表觀、轉錄和轉錄后水平調控基因的表達〔6〕。已有研究表明LncRNAs參與多種惡性腫瘤的發生和發展，LncRNAs具有作為人類癌癥診斷和治療生物標志物的作用〔7〕。此外，某些LncRNAs的異常表達可能調控包括前列腺癌在內的多種癌癥的化療耐藥性〔8〕。LINC00595是一種新發現的LncRNA，目前尚無LINC00595參與前列腺癌細胞對DTX耐藥調控的有關報道。PC3細胞系是從人前列腺癌骨轉移腫瘤中分離出來的細胞，其分化程度低，為雄激素非依賴性前列腺癌細胞，不具有內源性的雄激素受體，具有中等強度的轉移潛能，被廣泛用于雄激素抵抗型前列腺癌的研究〔9〕。本研究探討LINC00595對前列腺癌PC3 DTX耐藥細胞增殖、凋亡及酪氨酸激酶受體(Trk)B表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人前列腺癌PC3細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；DMEM培養基和胎牛血清均購自美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)和Docetaxel購自美國Sigma公司；Trizol和Lipofectamine 2000試劑盒均購自美國Invitrogen公司；Prime Script RT reagent Kit購自大連寶生生物公司；MTS細胞增殖檢測試劑盒購自美國Promega公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基公司；LINC00595過表達質粒(ov-LINC00595)和對照質粒(ov-NC)均購自廣州萊德聯康生物公司；ABI Prism?快速7500型熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀購自美國Applied Biosystems公司；BD Calibur flow cytometer購自美國BD公司；倒置光學顯微鏡(OLYMPUS CKX41，U-CTR30-2)購自日本OLYMPUS公司。酶標儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2細胞培養、轉染和DTX耐藥處理 人前列腺癌PC3細胞系采用含有10%胎牛血清的DMEM培養液進行培養，并在37℃含5% CO2的培養箱中培養。用DMSO將DTX溶解配制成母液，然后按照先前報道的間歇逐步增加劑量法〔10〕將DTX添加于培養基中誘導前列腺癌細胞系PC3的DTX(PC3-DTX)耐藥性。PC3細胞先依次在含有4、8、12 nmol/L的DTX中培養3 w。隨后將存活的細胞重新傳代于新的DEME中培養2 w，接著用10 nmol/L的DTX開始處理，隨后逐漸增加5 nmol/L，最終劑量為50 nmol/L。含DTX的培養基每2～3 d更換1次。最后將PC3-DTX細胞在40 nmol/L的PC3-DTX培養維持1個月。

PC3-DTX細胞的轉染，包括LINC00595過表達質粒(ov-LINC00595)和對照質粒(ov-NC)，按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行操作。

1.3RT-qPCR檢測LINC00595 和TrkB mRNA的表達 收集經培養或處理后的前列腺癌PC3細胞或PC3-DTX細胞，Trizol試劑提取細胞中的總RNA，將RNA逆轉錄成cDNA，PCR檢測細胞中LINC00595和TrkB mRNA表達。以GAPDH作為內參，根據2-ΔΔCt法計算LINC00595和TrkB相對表達。

1.4MTS法檢測細胞增殖 MTS法檢測PC3細胞和PC3-DTX細胞的增殖，并計算PC3細胞和PC3-DTX細胞的IC50值。將PC3細胞和PC3-DTX細胞在培養箱中預培養24 h，向培養板中加入不同濃度的DTX(10、50、100、200、400、800 nmol/L)，并設置不加細胞液的對照孔，每種處理設3個復孔。孵育24 h后，MTS法檢測細胞增殖，酶標儀上測定細胞在490 nm處的吸光度值，計算細胞對DTX的抑制濃度值(IC50)。MTS法檢測PC3-DTX細胞增殖，將正常培養的PC3-DTX細胞(空白組)、轉染LINC00595過表達質粒(ov-LINC00595)和對照質粒(ov-NC)后的PC3-DTX細胞接種至96孔板中，隨后按照MTS檢測試劑盒方法檢測轉染后細胞經培養0、24、48、72 h后，酶標儀上測定細胞在490 nm波長下的吸光度。

1.5克隆形成分析檢測細胞的生長情況 將正常培養的PC3-DTX細胞(空白組)、轉染LINC00595過表達質粒(ov-LINC00595)和對照質粒(ov-NC)后的PC3-DTX細胞接種于6孔板中，培養14 d后吸去培養液并用PBS洗滌細胞，隨后甲醛固定細胞，最后用結晶紫對細胞進行染色后于顯微鏡下觀察并統計克隆形成情況。

1.6流式細胞實驗檢測細胞的周期和凋亡 將正常培養的PC3-DTX細胞(空白組)、轉染LINC00595過表達質粒(ov-LINC00595)和對照質粒(ov-NC)的PC3-DTX細胞經培養48 h后，離心收集細胞，按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒說明書在BD的流式細胞儀上對細胞周期和凋亡進和檢測分析。

1.7統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1PC3-DTX細胞的耐藥性 細胞耐藥增殖結果顯示，PC3-DTX細胞組對DTX的IC50值顯著高于正常培養的PC3細胞組(P<0.001)。表明PC3-DTX耐藥株構建成功。見表1。

2.2LINC00595及TrkB在PC3-DTX細胞中的表達 RT-qPCR結果顯示，與正常培養的PC3細胞組相比，PC3-DTX細胞組中LINC00595相對表達水平顯著降低(P<0.01)，而TrKB相對表達水平顯著上調(P<0.001)。見表1。

表1 PC3-DTX細胞耐藥性及LINC00595、TrkB mRNA相對表達水平

2.3PC3-DTX細胞中的過表達LINC00595 PC3-DTX細胞經過轉染后，與ov-NC組相比，ov-LINC00595組的PC3-DTX細胞中LINC00595相對表達水平顯著上調(P<0.001)。見表2。

2.4過表達LINC00595對PC3-DTX細胞增殖的影響 MTS實驗結果顯示，與ov-NC組相比，經培養48和72 h這2個時間點，ov-LINC00595組細胞的吸光度值顯著下降，其中培養72 h后表現最顯著(均P<0.05)。見表2。

表2 PC3-DTX細胞中LINC00595表達水平及轉染ov-LINC00595對PC3-DTX細胞增殖的影響

2.5過表達LINC00595對PC3-DTX細胞周期的影響 與轉染ov-NC組相比，轉染ov-LINC00595組的PC3-DTX細胞中S期的細胞比例顯著降低(P<0.05)，而G2期的細胞比例顯著增加(P<0.01)。見圖1和表3。

表3 過表達LINC00595對PC3-DTX細胞周期的影響

圖1 流式細胞儀檢測PC3-DTX細胞周期

2.6過表達LINC00595對PC3-DTX細胞凋亡及細胞克隆形成的影響 與轉染ov-NC組相比，轉染ov-LINC00595組的PC3-DTX細胞中凋亡細胞比例顯著增加，而克隆形成細胞數目顯著減少(均P<0.001)。見表4、圖2、圖3。

圖2 流式細胞儀檢測PC3-DTX細胞凋亡

圖3 結晶紫染色檢測PC3-DTX細胞克隆形成(×200)

2.7過表達LINC00595對PC3-DTX細胞中TrkB mRNA表達的影響 PC3-DTX細胞經過轉染后，與轉染ov-NC組相比，轉染ov-LINC00595的PC3-DTX細胞中TrkB mRNA相對表達水平顯著減少(P<0.001)。見表4。

表4 過表達LINC00595對PC3-DTX細胞凋亡、細胞克隆形成及TrkB mRNA表達的影響

3 討 論

DTX是紫杉烷衍生的具有抗細胞有絲分裂的藥物，被認為是臨床治療前列腺癌的一種有效的化療藥物，而大多數前列腺癌患者最終會產生DTX耐藥性，使得其化療效果不再有效，患者不得不被動面對腫瘤惡化甚至死亡〔11〕。探索其耐藥機制對前列腺癌患者預后具有重要的臨床意義。

研究表明，有些LncRNAs失調會導致許多腫瘤發生發展，而有些LncRNAs會影響腫瘤對DTX的化療敏感性〔12，13〕。如LncRNA DANCR在DTX耐藥前列腺癌細胞中表達明顯上調，沉默LncRNA DANCR表達通過靶向調控miR-34a-5p/JAG1途徑增強DTX耐藥前列腺癌細胞對DTX的敏感性〔14〕。Gao等〔15〕研究表明，LncRNA癌易感性侯選基因(CASC)2在前列腺癌組織和細胞系中表達均下調，LncRNA CASC2過表達可抑制前列腺癌細胞增殖，促進細胞凋亡，增強細胞對多西紫杉醇的敏感性。LINC00595作為一種新發現的LncRNA，Riege等〔16〕研究發現LINC00595在真菌和細菌感染中具有刺激特異性免疫調節活性的LncRNA標記基因的特性。而LINC00595在DTX耐藥中的作用未見報道，其作用也尚不清楚。本研究通過建立人DTX耐藥細胞系和PC3-DTX作為體外細胞模型，結果表明體外PC3-DTX細胞模型構建成功，提示LINC00595在PC3-DTX細胞中異常表達，可能在PC3細胞的耐藥中發揮重要作用。研究表明，有一小部分(約3%)的LncRNA在腫瘤中表達失調，并介導腫瘤細胞增殖和生長〔17〕。細胞過度增殖是腫瘤發展的重要特性。本研究提示過表達LINC00595對PC3-DTX細胞增殖和生長均有顯著的抑制作用。此外，表明過表達LINC00595抑制PC3-DTX細胞增殖可能與其抑制細胞周期轉化有關。本研究發現在PC3-DTX細胞中過表達LINC00595能顯著促進PC3-DTX細胞發生凋亡。Trk1家族在細胞凋亡、增殖和浸潤中發揮著極其重要的受體信號調控作用，在許多腫瘤中出現過表達現象〔18〕。TrkB能誘導胞內酪氨酸殘基磷酸化，使細胞內信號分子發生磷酸化，通過激活下游大鼠肉瘤基因(RAS)-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)等信號通路，上調上皮間質轉化(EMT)相關的轉錄因子表達，引起腫瘤發生侵襲和轉移及獲得化療耐藥等〔19〕。本研究結果表明，過表達LINC00595能增強前列腺癌細胞PC3對DTX的敏感性。然而，本研究僅為體外細胞實驗，其具體的有效性還需進一步在動物體內展開實驗研究驗證。