四君子湯對(duì)結(jié)腸癌小鼠腸道菌群及免疫功能的調(diào)節(jié)作用

歐陽慶武 費(fèi)雁 魏運(yùn)姣 段青

(武漢市第四醫(yī)院 1綜合病房；湖北 武漢 430000；2腫瘤科)

結(jié)腸癌是世界第3大惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率因人們飲食結(jié)構(gòu)、所處環(huán)境、生活方式的不同而存在差異；據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年約有120萬患者被診斷為結(jié)腸癌，超過60萬患者因結(jié)腸癌死亡〔1，2〕。我國國家中央癌癥登記處數(shù)據(jù)顯示：結(jié)腸癌患者中男性多于女性，城市人口多于農(nóng)村，2011年約有15萬結(jié)腸癌患者死亡，并且其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)〔3〕。結(jié)腸癌的發(fā)生是遺傳多態(tài)性與多種不良因素共同作用的結(jié)果，有研究表明，腸道菌群失衡會(huì)通過不同形式導(dǎo)致癌癥的發(fā)生〔4〕。化療、外科手術(shù)治療是結(jié)腸癌主要治療方式，雖然術(shù)后輔助化療在一定程度上降低了腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，但其對(duì)患者毒副作用較大〔5〕，尋找高效低毒的治療方式具有重要意義。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療具有悠久的臨床應(yīng)用歷史，因其毒副作用小、來源于天然藥物而受到廣泛重視。隨著對(duì)中醫(yī)藥療法的不斷研究，學(xué)者發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥輔助結(jié)腸癌的治療有助于改善患者身體免疫功能及預(yù)后，取得顯著療效〔6〕。四君子湯由人參、白術(shù)、茯苓、甘草4味中草藥組成，具有補(bǔ)氣、益氣、健脾的功效，可通過免疫分子、免疫細(xì)胞、免疫器官、胃腸道調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能〔7〕。此外，四君子湯具有抗腫瘤、抗疲勞、耐氧、修復(fù)肝臟等作用，常用于癌癥的輔助治療〔8〕。本文以四君子湯灌胃結(jié)腸癌模型小鼠，以研究四君子湯對(duì)小鼠腸道菌群、免疫功能及移植瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1材料 6～8周齡雄性BALB/c小鼠購自北京維通利華公司；人參、白術(shù)、茯苓、甘草購自同仁堂大藥房；CT26結(jié)腸癌細(xì)胞(批號(hào)：CRL-2638)購自ATCC細(xì)胞庫；胎牛血清(批號(hào)：10099-141)、DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)：31053028)、胰蛋白酶(批號(hào)：20230)購自賽默飛世爾科技有限公司；4%多聚甲醛(批號(hào)：P1110)、免疫球蛋白(Ig)G酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(批號(hào)：SEKS-0034)、IgA ELISA試劑盒(批號(hào)：SEKB-0002)、IgM ELISA試劑盒(批號(hào)：SEKS-0035)購自北京Solarbio公司；ACK紅細(xì)胞裂解液(批號(hào)：CS0001)購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；瑞氏染色液(批號(hào)：HB8286)購自青島海博生物技術(shù)有限公司；德國偉力真空泵視油鏡購自東莞捷勝真空機(jī)械設(shè)備有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；流式細(xì)胞儀購自Miltenyi Biofec公司。

1.2動(dòng)物模型制造及分組 將60只BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)選取10只設(shè)為對(duì)照組，50只設(shè)為模型組。對(duì)照組：正常飼養(yǎng)不做任何處理；模型建立：按照郭亞榮等〔9〕的方法，運(yùn)用氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸癌模型；將造模小鼠隨機(jī)分為5組每組10只，分別設(shè)為：模型組，四君子湯0.125 ml(低劑量組)、四君子湯0.250 ml(中劑量組)、四君子湯0.500 ml(高劑量組)、模型+陰性對(duì)照組。從中篩選最適濃度(四君子湯0.5 ml)標(biāo)記為四君子湯組。四君子湯給藥方法：以四君子湯水煎劑0.125、0.250、0.500 ml/次(1 g生藥/ml)進(jìn)行灌胃，2次/d，連續(xù)灌胃7 d；模型+陰性對(duì)照組以無菌生理鹽水代替四君子湯行灌胃處理。模型組和對(duì)照組進(jìn)行正常飼養(yǎng)，不做任何處理。第8天對(duì)所有實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行眼眶靜脈采血、斷頸法處死小鼠、小心摘取腫瘤、脾臟和腎臟并稱重、無菌采取盲腸內(nèi)容物0.1 g，均置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3小鼠腸道菌群檢測(cè) 腸道菌群中雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、腸桿菌的含量檢測(cè)參考吳秀等〔10〕的方法，將盲腸內(nèi)容物樣品無菌條件下恢復(fù)至室溫，放入無菌離心管中，加入生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋(10-1、10-2、10-3)；取3個(gè)稀釋度的樣品各10 μl均勻涂布于選擇性培養(yǎng)基上，倒置于35℃ 恒溫培養(yǎng)箱中，腸桿菌需氧培養(yǎng)24 h，雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌厭氧培養(yǎng)48 h，觀察計(jì)數(shù)。結(jié)果按照菌落形成單位/g的對(duì)數(shù)(logCFU/g)表示。

1.4主要免疫器官指數(shù) 稱量剝離的小鼠脾臟、胸腺、瘤體重量，測(cè)量瘤體最長徑和最短徑，計(jì)算脾和胸腺指數(shù)及瘤體體積。計(jì)算公式：指數(shù)(mg/g)= 免疫器官質(zhì)量(mg)/體重(g)；瘤體體積(mm3)=(π×瘤體最長徑×最短徑2)/6。

1.5小鼠血清IgG、IgA、IgM水平檢測(cè) 將麻醉后的小鼠腹部向上固定在操作臺(tái)上，剪開皮膚，暴露腹腔。手持穿刺針30°斜向下刺入主動(dòng)脈，抽取血液，用離心半徑10 cm的離心機(jī)447 r/min離心15 min，收集血清，-20℃ 保存。ELISA檢測(cè)小鼠血清中IgG、IgA、IgM水平。

1.6小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+水平檢測(cè) 取100 μl小鼠全血，加入含相應(yīng)抗體的EP管中，4℃ 暗室孵育30 min，加入紅細(xì)胞裂解液，混勻后避光靜置10 min，加入500 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次，離心棄上清。2%多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀分析T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+比例。

1.7巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè) 處死小鼠前30 min將1%雞紅細(xì)胞(CRBC)懸液0.5 ml注入小鼠腹腔，輕輕揉腹。處死小鼠后取腹腔液涂片，自然風(fēng)干后瑞氏染色，使用油鏡隨機(jī)觀察100個(gè)巨噬細(xì)胞。吞噬百分率 =(吞噬CRBC的巨噬細(xì)胞數(shù)/100)×100%；吞噬指數(shù)= 吞噬細(xì)胞吞噬的CRBC數(shù)/100。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1四君子湯對(duì)結(jié)腸癌模型小鼠腸道菌群的影響 與對(duì)照組相比，模型組雙歧桿菌、乳酸桿菌水平顯著降低(P<0.05)，腸球菌、腸桿菌水平顯著升高(P<0.05)；經(jīng)用四君子湯治療后，小鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、腸桿菌4種菌群基本恢復(fù)至正常水平，與模型+陰性組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。且高劑量組作用最顯著，故選用0.5 ml用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 四君子湯對(duì)結(jié)腸癌模型小鼠腸道菌群的影響

2.2四君子湯對(duì)結(jié)腸癌模型小鼠主要免疫器官臟指數(shù)的影響 模型組脾、胸腺指數(shù)較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；而經(jīng)四君子湯灌胃治療后，脾和胸腺指數(shù)在一定程度上顯著提升(P<0.05)，接近正常水平。見表2。

表2 四君子湯對(duì)結(jié)腸癌模型小鼠主要免疫器官指數(shù)的影響

2.3四君子湯對(duì)結(jié)腸癌模型小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 模型組巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)；高劑量組巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)與模型+陰性對(duì)照組比顯著回升(P<0.05)，接近正常水平。見表3。

表3 四君子湯對(duì)結(jié)腸癌模型小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

2.4四君子湯對(duì)結(jié)腸癌模型小鼠血清IgG、IgA、IgM水平的影響 與對(duì)照組相比，模型組血清IgG、IgA、IgM水平顯著降低(P<0.05)；而經(jīng)四君子湯灌胃治療后，與模型+陰性對(duì)照組比較血清IgG、IgA、IgM水平顯著升高，基本回升至正常水平(P<0.05)。見表4。

表4 四君子湯對(duì)結(jié)腸癌模型小鼠血清IgA、IgA、IgM水平及外周血CD3+ 、CD4+ 、CD8+水平的影響

2.5四君子湯對(duì)結(jié)腸癌模型小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組血清CD3+、CD4+水平降低(P<0.05)，CD8+水平升高(P<0.05)，CD4+/CD8+比值下降(P<0.05)；而經(jīng)四君子湯治療后，小鼠血清CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+比值基本恢復(fù)至正常水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表5。

圖1 細(xì)胞流式圖

2.6四君子湯對(duì)結(jié)腸癌模型小鼠瘤體質(zhì)量和體積的影響 經(jīng)四君子湯治療小鼠體內(nèi)瘤體質(zhì)量和體積均小于模型+陰性對(duì)照組(P<0.05)。見表5、圖2。

表5 四君子湯對(duì)結(jié)腸癌模型小鼠瘤體質(zhì)量和體積的影響

圖2 四君子湯對(duì)結(jié)腸癌模型小鼠瘤體的影響

3 討 論

結(jié)腸癌的發(fā)生可能與年齡、飲食、肥胖、飲酒等因素有關(guān)，其中，腸道菌群穩(wěn)態(tài)的失衡被認(rèn)為能夠直接誘發(fā)結(jié)腸癌〔11，12〕。人體腸道菌群是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，包括大量類桿菌、雙歧桿菌、消化球菌等專性厭氧菌，其中雙歧桿菌和類桿菌占90%以上，少量為腸球菌、大腸桿菌、乳酸桿菌等〔13〕。腸道微生物群在腸道結(jié)構(gòu)、免疫及代謝作用中起重要作用，通過其代謝物如酚類化合物、胺類、亞硝基化合物、CO2等參與碳水化合物、蛋白的水解發(fā)酵，從而影響腸上皮細(xì)胞增殖和分化〔14〕。腸道微生物組成的改變可能有利于致癌細(xì)菌的滋生，影響結(jié)腸癌相關(guān)的微環(huán)境〔15〕。此外，研究發(fā)現(xiàn)：大腸桿菌可產(chǎn)生細(xì)胞致死膨脹毒素，誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB、腫瘤壞死因子α、白介素6等促炎因子產(chǎn)生，從而促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)展〔16，17〕；而雙歧桿菌、乳酸桿菌能夠誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞豐度；誘導(dǎo)IgA產(chǎn)生(IgA是腸道黏膜發(fā)揮免疫功能的重要分子)，抑制結(jié)腸癌的發(fā)生〔18，19〕。已有證據(jù)〔20〕表明：腸道微生物組成平衡的失調(diào)通過誘導(dǎo)炎癥或免疫反應(yīng)而引發(fā)結(jié)腸癌。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，其藥效發(fā)揮與腸道微生物組成密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道〔21，22〕，黨參、白術(shù)、山藥、黃芪等健脾中藥能夠促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌生長，調(diào)節(jié)腸道蠕動(dòng)功能，使腸道菌群穩(wěn)態(tài)保持平衡；補(bǔ)中益氣湯可顯著提高小鼠血清CD4+/CD8+比值，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)小鼠體細(xì)胞免疫功能。四君子湯是治療脾胃氣虛的經(jīng)典方，其水煎劑包含多糖、皂苷類、黃酮類等化學(xué)成分。Yu等〔23〕研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯能夠降低腸道黏膜CD3+、CD8+T細(xì)胞含量并提高CD4+T細(xì)胞水平，從而調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在腫瘤的相關(guān)研究中，已有文獻(xiàn)報(bào)道稱：四君子湯能夠通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞降低肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率〔24〕，并且通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放從而激活半胱氨酸蛋白酶3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用〔25〕。此外，已有研究表明：四君子湯可作為臨床常用化療藥物氟尿嘧啶(5-FU)的增效劑，增強(qiáng)5-FU對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長的抑制作用。

綜上所述，四君子湯能夠維持腸道微生態(tài)平衡，通過調(diào)節(jié)免疫球蛋白和T淋巴細(xì)胞亞群提高機(jī)體免疫力，抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長；本研究結(jié)果為臨床上應(yīng)用四君子湯輔助治療結(jié)腸癌提供了一定的理論依據(jù)。